【正文】 清蛋白是完全蛋白質。 β半乳糖苷酶在食品工業(yè)中的應用 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖 解決乳糖不耐癥患者的乳品消費問題牛乳中含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物以及幾乎全部已知的維生素，尤其是牛乳中含有豐富的鈣質，且極易被人體吸收，被譽為“近乎完善的食物”。酵母菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶最適pH近于中性，與牛乳的天然pH值接近，最適溫度較低，適于處理牛乳和甜乳清中的乳糖。 β半乳糖苷酶的來源及其特性β半乳糖苷酶存在于植物（尤其是杏、桃、蘋果），細菌（大腸桿菌、乳酸菌等），真菌（米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母等），放線菌以及哺乳動物（特別是嬰兒）的腸道中。1985年東北農(nóng)業(yè)大學的萬賢生對β半乳糖苷酶在乳清中的綜合利用展開了研究。1944年Whitter[1]就比較全面的討論了β半乳糖苷酶的應用。因此，乳酸菌可以廣泛用于各種乳品加工生產(chǎn)低乳糖制品。但是由于乳糖不耐癥的存在，很多人難以食用牛奶或其他乳制品，這極大地抑制了乳品行業(yè)的發(fā)展。其結構基因為LacZ(半乳糖苷酶)，與LacY（半乳糖苷透性酶）和LacA（半乳糖苷轉乙酰酶）共同組成乳糖操縱子，并在特異的乳糖操縱系統(tǒng)中的阻遏物、操縱基因、啟動子等的協(xié)同下，支配調節(jié)β半乳糖苷酶的合成。但固定化酶珠體機械強度較差，尚待改進。摘 要摘 要從土壤中篩選出一株產(chǎn)β半乳糖苷酶的枯草芽孢桿菌，并對菌株和其產(chǎn)生的β半乳糖苷酶進行了測定。關鍵詞：β半乳糖苷酶 酶活性 酶的固定化IAbsractAbsractA strain isolated from soil in producing βgalactosidase of Bacillus subtilis, and strains and βgalactosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was %, the best culture time 24h。當培養(yǎng)基中無誘導物質時，每一細胞中雖然沒有幾個分子的β半乳糖苷酶，但一旦被誘導，則每一世代都能合成多達幾千個分子的酶。乳糖消化的程度取決于以下幾種因素：乳糖攝入量、在腸胃內停留時間（由飲食時間決定）、β半乳糖苷酶攝入量以及乳制品攝入量。采用篩選出的菌種進行酸奶加工，驗證其加工性能，掌握其工藝加工性能和應用于乳品加工的潛力，從而將其應用于乳品發(fā)酵產(chǎn)品，降低乳糖含量，緩解人體普遍存在的乳糖不耐癥，擴大乳品的消費量。1948年Caputto[2]等討論了通過大量培養(yǎng)和純化脆壁酵母（Saccharimyces fragilis）生產(chǎn)β半乳糖苷酶的方法。上海復旦大學的郭杰炎等以乳酸酵母Y121發(fā)酵生產(chǎn)的β半乳糖苷酶活力達40u/ml（ONPG單位），干燥制成的酶粉冰箱保藏半年，酶活殘存98%。目前僅來源于微生物的β半乳糖苷酶有工業(yè)應用價值，利用微生物發(fā)酵法制取β半乳糖苷酶，酶源豐富，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，周期短，而且不受季節(jié)、地理位置等因素的影響。脆壁酵母和乳酸酵母（Saccharimyces lactic）是生產(chǎn)β半乳糖苷酶的主要酵母菌種。但據(jù)有關資料報道，有10％的白人，51％的印第安人，81％的非裔加勒人和70％的亞洲人由于腸道內缺乏β半乳糖苷酶而患有程度不同的乳糖不適癥(又稱乳糖不耐癥)[7]。世界年產(chǎn)量約為9180。該法簡便快捷，費用低廉，又可以在樣品不除去蛋白的情況下使用，適合于在食品工業(yè)上進行應用[12]。 產(chǎn)β半乳糖苷酶菌的篩選 菌株篩選方法 取土樣，稀釋10倍，置于80℃水浴鍋中加熱30min，以去除不產(chǎn)芽孢的菌體。取 7 支試管分別吸取 0， ， ， ， ， ， ， ， 5mmol/ml ONP，補上述緩沖液至 ，然后 40℃保溫15min，加入 2mL ，1mol/LNaCO3，以第一管為空白，于 420nm 測定吸光度，以 ONP 的量為橫坐標，以 A420 為縱坐標繪制標準曲線。 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶能力的影響將種子菌液以2％的比例接種到裝有30 mL基礎培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中．在37℃、225 r/min的條件下培養(yǎng)，分別于0、1123460 h取樣，每個處理重復3次，測定生物量和酶活性并繪制曲線。東北電力大學學士畢業(yè)論文第3章 β半乳糖苷酶酶學性質 高產(chǎn)β半乳糖苷酶細菌的篩選用土壤為樣本，以乳糖為唯一碳源，篩選出乳糖利用菌株。因此，以下試驗均采用單菌落培養(yǎng)10 h的菌液作為種子菌液。圖35 接種量對產(chǎn)酶能力的影響 pH對酶活性和穩(wěn)定性的影響pH值對酶催化反應的影響分別為影響酶催化底物轉變成產(chǎn)物效率以及酶的穩(wěn)定性。Fe2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+和Cu2+對β乳糖苷酶酶活有抑制作用，且隨濃度增加抑制作用加強，其中Cu2+的抑制作用最強。這大大地阻礙了酶工程的發(fā)展應用。固定化酶的研究始于 1910 年，正式研究于 20 世紀 60 年代，70 年代已在全世界普遍開展。交聯(lián)法又稱為架橋法，是借助于雙功能或多功能試劑與酶分子中的氨基或羧基發(fā)生反應，使酶蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)，結成網(wǎng)狀結構而制成固定化酶。其缺點是由于攪拌漿產(chǎn)生的剪切力較大，常會引起固定化酶的破壞。適合于存在有產(chǎn)物抑制的催化反應。例如，酶可被包埋于中空纖維內，然后再把纖維束放置于反應器內。具體結果如表4所示：固定化方法Vmax（u/ml）Km（mM）相對活性（%）酶活力（U）GCP交聯(lián)法GCP芳香胺交聯(lián)法卡拉膠包埋法物理吸附法游離酶//可見GCP一醛交聯(lián)法效果最好。固定化細胞在4℃儲存2個月，水解效率不變。 國內研究進展我國的學者對β半乳糖苷酶的固定化也展開了一些研究，但尚未見到進行工業(yè)化生產(chǎn)低乳糖奶的報道。潘道東(1991)，用卡拉膠包埋法制備固定化脆壁酵母β半乳糖苷酶，活力回收率可達83%，可以在實驗條件下有效水解乳清、脫脂乳和全脂乳中的乳糖，在45℃下，水解半衰期均在1 69200小時，但是卡拉膠的機械強度差，不適合工業(yè)化應用。可知海藻酸鈉固定化酶的酶活有不同程度損失，海藻酸鈉濃度低時，酶泄漏嚴重，清洗酶珠時，酶損失較多，酶活力下降，海藻酸鈉濃度高時，微環(huán)境效應和擴散陰力對反應影響更大。在實際應用中，一種固定方法常不能達到理想的結果，往往幾種固定方法聯(lián)合使用。可知固定化酶與游離酶的最適溫度都在35~40℃范圍內。外擴散是發(fā)生在固定化酶表面周圍的能斯特層，由底物從大環(huán)境主體溶液中向固定化酶表面?zhèn)鬟f引起，它使得底物在固定化酶周圍形成濃度梯度，隨攪拌速度增加而減少；內擴散阻力發(fā)生在多孔固定化酶載體的內部、底物或其它效應物在載體顆粒表面與載體內的酶活性部位間運轉過程中的擴散限制。在半乳糖作為 β半乳糖苷酶的保護劑的作用下，固定化過程也相對穩(wěn)定地進行了下來。作為 β半乳糖苷酶的酶反應終產(chǎn)物，半乳糖也可以在某種程度上對β半乳糖苷酶進行產(chǎn)物抑制，從而 β半乳糖苷酶構象的改變。這三種效應的產(chǎn)生都是由于酶和固定化載體發(fā)生了相互作用，因此主要取決于固定化的條件和方法，但部分也取決于載體的性質。通?；|溶于連續(xù)相水中，固定化酶懸浮于其中，以單基質反應為例(S—P)，基質S從反應液主體傳遞到固定化酶微粒外表面，然后擴散到粒子的酶分子上，而生成物P則剛好與此途徑相反。起初取1%，2%，3%，4%，5%戊二醛作為交聯(lián)劑，反應后發(fā)現(xiàn)溶液無顯著變色現(xiàn)象，表明高濃度的戊二醛將導致酶活力下降，這可能是因為酶分子活性基團被戊二醛過多地修飾，%，%，%，%的戊二醛作為交聯(lián)劑，將lmL酶液和海藻酸鈉混合液滴入由10mL CaCl2溶液和l0mL戊二醛溶液組成的混合溶液中，反應15min，結果見圖464，%時聯(lián)合固定化酶的活力最高，交聯(lián)劑濃度過高時，使酶本身變性失活，酶活力下降。圖461 海藻酸鈉濃度對固定化酶酶活的影響 CaCl2濃度的確定分別配置濃度為1%，2%，3%，4%，5%的CaCl2溶液各20mL置于燒杯中，在相同條件下用4％海藻酸鈉進行酶固定化處理，固定時間為1h，固定化酶與底物精確反應10min，加入Na2CO3溶液中止反應，測吸光值，結果見462。本文以海藻酸鈉為包埋載體，戊二醛為交聯(lián)劑，對乳糖酶進行固定化嘗試，探討了固定化的最適條件及固定化酶的部分性質。李緒淵等人將來自鷹嘴豆B一半乳糖苷酶固定在聚丙烯酰胺上，活力回收率為72%。用纖維素包埋酵母乳糖酶已有工業(yè)規(guī)模應用，用其間歇處理預先超高溫消毒的牛奶。固定化酶的特性幾乎與游離酶相同，在巴氏消毒牛奶中65℃固定化酶的半衰期為450小時，體現(xiàn)了工業(yè)用于生產(chǎn)低乳糖牛奶的前景。另一種方式是把酶保留在纖維的外側，而底物則流經(jīng)纖維內腔。底物以一定的流速從下向上流過，使固定化酶顆粒在流體中維持懸浮狀態(tài)并進行反應，這時的固定化顆粒和流體可以看作是均勻混合的流體。此外還可將載有酶的圓片聚合物，固定在攪拌軸上或者將固定化酶放置在與攪拌軸一起轉動的金屬網(wǎng)筐內，這樣既能保證反應液攪拌均勻，同時又不致?lián)p壞固定化酶。與共價結合法一樣，由于酶的功能團(如氨基、巰基和咪唑基)參與反應可能引起酶活性中心結構的改變，使酶活力下降。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應特性的同時，又克服了游離酶的不足之處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點。固定化酶技術是把從生物體內提取出來的酶，用人工方法固定在特定的載體上。表38 金屬離子對酶活性影響試劑相對酶活100%1mmol/L10mmol/L100mmol/L空白對照Fe3+ndFe2+K+Na+