【正文】 高密度發(fā)酵 高密度發(fā)酵也稱為高密度發(fā)酵技術(shù)，是一種高效 表達(dá)外源蛋白表達(dá)水平的重要戰(zhàn)略。 種子質(zhì)量：在工程菌在發(fā)酵過程中，畢赤酵母菌種的培養(yǎng)是一個極其重要的組成部分。 pH 值：菌體的生長階段或誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo) 蛋白的的階段， pH 值是非常重要的影響因素。 試驗(yàn)材料 菌種 用于實(shí)驗(yàn)的菌種是由本實(shí)驗(yàn)室保存的植酸酶畢赤酵母基因工程菌。接種適量的優(yōu)質(zhì)菌種，培養(yǎng) 22 小時。誘導(dǎo)后 72 小時測定菌液濃度和測定發(fā)酵 液中植酸酶活性。培養(yǎng) 22 小時，細(xì)胞濃度達(dá)到一個高峰，然后進(jìn)入了一個穩(wěn)定的時期，正增長和負(fù)增長，在一個動態(tài)的平衡，生長速率常數(shù) R 是幾乎為零，反映了細(xì)胞濃度的上升。因此，選擇畢赤酵母接種最佳種齡為 20 小時。這表明，對于此次試驗(yàn)的工程菌來說，細(xì)胞生長和誘導(dǎo)產(chǎn)酶的最適 pH值的最佳 pH 值是不一致的。次生代謝產(chǎn)物，穩(wěn)定期左右才被合成，一般被分為兩個不同時期，細(xì)菌的生長階段和次生代謝產(chǎn)物階段。 在誘導(dǎo)期，甲醇作為唯一碳源對細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)酶提供能量。因此，甲醇選擇加入 ， 12 小時的額外添加時間。 036912151821240 12 24 36 48 60 72 84 96誘導(dǎo)時間（ h ）酶活（KU/mL） 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 21 頁 共 29 頁 圖 29 甲醇單一碳源誘導(dǎo)曲線 Induction curve of useing methanol as single carbon source 03691215182124270 12 24 36 48 60 72 84 96誘導(dǎo)時間（ h ）酶活（KU/mL） 圖 210 山梨醇 甲醇混合碳源誘導(dǎo)曲線 Induction curve of useing sorbitol methanol mixed carbon sources 由圖 29 和圖 210 的結(jié)果顯示，最初的 12 小時酶活性增加非常緩慢，因?yàn)楣こ叹€未適應(yīng)甲醇環(huán)境，工程菌誘導(dǎo)后 12 小時后， 已適應(yīng)甲醇的環(huán)境，并開始產(chǎn)生植酸酶，酶活先快后慢，最終穩(wěn)定下來，活性不再增加。 01234567892 6 10 14 18 22培養(yǎng)時間（ h ）菌體濃度（OD600）p H 5 . 0 p H 5 . 5 p H 6 . 0 p H 6 . 5 圖 211 生長階段 pH 對菌體濃度的影響 The effect of pH on yeast concentration at growth phase 從圖 211 可以看出，在發(fā)酵罐的菌體生長階段， pH 值 時，菌體濃度最高，再者就是 pH 為 ，當(dāng) pH值 ，細(xì)胞濃度最小，所以我們可以看到，過低的 pH值是不利于細(xì)菌的生長。 182022245. 0 5. 5 6. 0 6. 5 7. 0培養(yǎng)基 pH菌體濃度（OD600）26272829303132酶活（KU/mL）菌體濃度 酶活 圖 212 誘導(dǎo)階段 pH 對菌體濃度和產(chǎn)酶的影響 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 24 頁 共 29 頁 The effect of pH on yeast concentration and the production of phytase at inducing phase 圖 212 顯示， pH 值 至 范圍內(nèi)，植酸酶酶活性隨 pH 值的增加而增加，活性達(dá)到最大是在 pH 時， pH值超過 ，植酸酶酶活性降低。最終酶活達(dá)到 25365U/mL 發(fā)酵液。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 27 頁 共 29 頁 參考文獻(xiàn) 1 李洪淼 .植酸酶畢赤酵母基因工程菌 [D] .四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文， 20xx,6 月 2 李曉龍 , 楊合同 , 吳遠(yuǎn)征 , 等 . 植酸酶的多樣性及其分類 [J] . 農(nóng)產(chǎn)食品科技 , 20xx,5 月 3 杜麗敏 , 段相林 . 植酸酶的來源與應(yīng)用 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科技 , 20xx, 8 月 4 施安輝 , 王光玉 . 目前國內(nèi)外植酸酶研究進(jìn)展 [ J] . 中國釀造 , 20xx( 5) : 5~ 10. 5 李秀娟 , 尹玲 , 李秀珍 , 黃賢剛 . 植酸酶畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J] . 20xx, 5 月 6 汪世華 , 呂茂洲 , 孫長春 , 等 . 植酸酶的現(xiàn)狀及其研究進(jìn)展 . 20xx, 9 月 7 楊燕凌 , 沙莉 , 方金銅 . 微生物植酸酶的研究與應(yīng)用 . 武夷科學(xué) , 20xx, 23: 191195 8 郭會燦 , 杜娜 . 植酸酶在工業(yè)中的應(yīng)用 . 河北工業(yè) , 20xx, 31(11): 1011 9 葉冰 , 王運(yùn)吉 , 張苓花 . 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵 . 大連輕工業(yè)學(xué)報 , 20xx, 21(3): 193196 10 周德慶 . 微生物學(xué)教程 . 第 2 版 . 北京：高等教育出版社 , 20xx: 159160 11 M. 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Statistial Optimization of the Medium 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 28 頁 共 29 頁 Components by Response Surface Methodology to Enhance Phytase Production by Pichia Biochem, 20xx, 37: 9991004 。發(fā)酵罐發(fā)酵的生長階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 ，發(fā)酵罐發(fā)酵的誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基最適 pH 值為 ，搖瓶培養(yǎng)畢赤酵母條件與這些不同。 綜合工程菌搖瓶培養(yǎng)階段的最適 pH 發(fā)酵階段的最適 pH 值，發(fā)現(xiàn)無論是搖瓶或發(fā)酵，最適生長 pH 值與最佳產(chǎn)酶 pH 值不相同，搖瓶和發(fā)酵罐之間也有差異。 本 科 畢 業(yè) 論 文 第 23 頁 共 29 頁 23242526272829酶活（ K U / m L ）5. 0 5. 5 6. 0 6. 5生長階段培養(yǎng)基 pH 圖 212 生長階段 pH 對產(chǎn)酶的影響 The effect of pH on the production of phytase at growth phase 圖 212 可以看到植酸酶活性隨 pH 值的增加呈上升的趨勢，酶的活性最高是當(dāng)培養(yǎng)基的 pH 值 時。使用山梨醇 甲醇混合碳源時在 60h 活性最大，為25365U/mL。 25％的山梨醇和 100％甲醇比為 1:8,1:6,1:4,1:2 對照組不添加甲醇。然而，當(dāng)甲醇濃度過高，會抑制細(xì)胞生長。此次試驗(yàn)研究了細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)產(chǎn)酶與甲醇含量的影響。 將麥芽汁 麥麩培養(yǎng)基 pH 值分別調(diào)整為 、 、 、 、 在誘導(dǎo)階段做平行試驗(yàn)，誘導(dǎo)完成后測定菌體濃度和植酸酶的酶活性，結(jié)果如圖 25 所示。此次實(shí)驗(yàn)所選定的 1％， 3％， 5％，7％， 9％進(jìn)行平行試驗(yàn)。 此次研究分析不同菌種種齡對發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的影響，分別采取各種不同種齡的生長20 小時的菌種接種，產(chǎn)酶，誘導(dǎo)酶的活性測定后，前后種子。 對生產(chǎn)酶的影響：將麥芽汁 麥麩調(diào)好最適應(yīng)的 ph 值加入到 250mL 的燒瓶中，接種適量的優(yōu)質(zhì)菌種，培養(yǎng) 22 小時，離心機(jī)離心后棄去上清，裝入 25 毫升的最適應(yīng) ph 值的 麩皮培養(yǎng)基，細(xì)菌培養(yǎng)基重新懸浮，添加甲醇作為唯一碳源，誘導(dǎo) 72 小時后測定酶的活性。成本 科 畢 業(yè) 論 文 第 13 頁 共 29 頁 長階段的第一個 22 小時，每隔 4h 將 pH 值校準(zhǔn)一次。 菌體搖瓶培養(yǎng)條件研究 本節(jié)主要研究植酸酶工程菌菌種接種量的量，菌種的不同種齡，基因工程菌生長階段的培養(yǎng)基 pH 值，誘導(dǎo)階段 pH，甲醇補(bǔ)充量，補(bǔ)加的時間間隔，誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)階段，添加山梨糖醇 甲醇為混合碳源研究和篩選，以確定搖瓶階段最佳的生長和誘導(dǎo)條件。謝子文對畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)植酸酶的條件進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的生長階段的最適 pH 值為 ，誘導(dǎo)生產(chǎn)階段酶的最適 pH 值為 。種齡，是指種子生長年齡，就是多久才能做種。現(xiàn)在，有許多蛋白質(zhì) 高密度發(fā)酵，獲得高表達(dá)水平，如巴西三膠腈水解酶表達(dá)水平到 22 克 / L[11]，植酸酶表達(dá)達(dá) g / L[12]等。 pH值是一個重要的因素，在低 pH 值的植酸溶解度的溶解度是優(yōu)于在較高的 pH 值的溶解度。體外研究表明，多種因素影響植酸與蛋白質(zhì)結(jié)合的程度，包 括 pH 值，蛋白質(zhì)溶解度及來源和鈣的水平和飲食中的鎂。后者少，只占 4％至 5％的體重，但種類很多 , 功能各不相同，且都具有非常重要的生理功能。植酸酶有助于降低單胃動物飼料中的植酸分解，釋放無機(jī)磷，以充分滿足動物生長需要