【正文】 微生物病理實驗基本操作2－1 植物病理徒手制片技術(shù)一、實驗?zāi)康? 觀察植物病害病原物的形態(tài)，進(jìn)行病原物的分類鑒定，研究受病組織的組織結(jié)構(gòu)病變，受病植物組織與病原物的解剖學(xué)關(guān)系以及對于難得一見病原物的保存?zhèn)溆玫龋夹鑼⒉牧现瞥蛇m當(dāng)?shù)娘@微玻片標(biāo)本。（2）黑盤孢菌9 / 66黑盤孢目真菌的分生孢子梗產(chǎn)生在分生孢子盤上。引起的病害如番茄葉霉病、黃瓜黑星病等。②輪枝孢屬(Verticillium)分生孢子梗輪狀分枝，產(chǎn)孢細(xì)胞基部略膨大；分生孢子為內(nèi)生芽殖型，單細(xì)胞，卵圓形至橢圓形，單生或聚生。1－5 半知菌亞門及其所致病害的特點半知菌亞門的主要特點常見的有 4 種：（1）分生孢子梗束（synnema）：呈束狀，基部聚生在一起，頂部分散，著生孢子。典型特征是形成黑色粉狀的冬孢子。[棗層銹菌（P. ziziphivulgaris ）引起棗樹銹病]。子囊孢子橢圓形或仿綞形，單胞無色。子囊孢子橢圓形、無色，雙胞大小相等。②主要種類A、痂囊腔菌屬 Elsinoe6 / 66子囊在子囊腔中不規(guī)則散生，每個子囊腔只有一個球形子囊，子囊孢子長圓筒形，3隔 4 胞、無色。D、間座殼屬（Diaporthe）子囊殼埋生在子座基部，梨形或球形，黑色，頂端有短喙?fàn)钔黄?。如棉花炭疽?G.gossypii，蘋果梨炭疽病 。⑧白粉菌分屬依據(jù)：閉囊殼附屬絲的形狀和殼內(nèi)子囊的數(shù)目。形成白粉。無性繁殖是子囊孢子在子囊內(nèi)芽殖產(chǎn)生芽孢子，芽孢子還可繼續(xù)芽殖。②子囊孢子（Ascospore）：形態(tài)多種多樣，圓形，橢圓形，絲狀，單胞，雙胞，多胞，無色或有色。（2）子囊菌的無性繁殖產(chǎn)生分生孢子或孢子器，非常發(fā)達(dá)，形狀多樣，圓形，卵形，棒形，絲狀，鐮刀形(新月形)，蠟?zāi)c形，有單孢，雙孢，多孢。（2）孢囊梗從匍匐絲上長出，頂端形成孢子囊，內(nèi)生孢囊孢子，孢子囊壁破散出孢囊孢子。④卵孢子壁厚，表面有瘤狀突起。③有性生殖在藏卵器內(nèi)形成一個卵孢子。2 / 66與園藝植物有關(guān)的鞭毛菌(1)根腫菌屬（Plasmodiophora）由根腫菌屬的病菌引起的，在病組織內(nèi)這些呈魚卵狀排列的是病菌的休眠孢子囊。纖絲之間填充有膠質(zhì)鞘。(4)鞭毛菌大多具有水生習(xí)性，因此只有在高濕、多雨、低洼積水和通風(fēng)透光不好的條件下，侵染植物導(dǎo)致病害。(5)鞭毛菌繁殖時，有的整個營養(yǎng)體全部轉(zhuǎn)變?yōu)榉敝丑w，稱為整體產(chǎn)果，如壺菌；有的只是營養(yǎng)體的一部分轉(zhuǎn)變?yōu)闋I養(yǎng)體，稱為分體產(chǎn)果。共 31 條亞纖絲。休眠孢子囊在寄主細(xì)胞內(nèi)分散呈魚卵塊狀，萌發(fā)時產(chǎn)生前端有 2 根鞭毛長短不一的游動孢子。(4)霜霉科（Peronosporaaceae） ①高等的鞭毛菌，都是植物體上的活體寄生菌，菌絲蔓延在寄生的細(xì)胞間，以吸器伸入寄主的細(xì)胞內(nèi)吸收養(yǎng)分。1－2 接合菌亞門及其所致病害的特點接合菌亞門的主要特點（1）菌絲體無隔多核，細(xì)胞壁由甲殼質(zhì)組成。（3）有性生殖形成接合孢子（不常見）。有的有色，有的無色。在子囊內(nèi)排列的有散生，單列，雙列，并列，螺旋形排列。常見病狀：畸形，葉片皺縮、果實膨大等。⑤ 有性世代：寄生后期在菌絲的上部形成閉囊殼(小黑點)，有附屬絲，便于傳播。5 / 66白粉菌（閉殼菌）：菌絲以吸器吸收營養(yǎng)；子囊著生在閉囊殼內(nèi)，外部有附著絲；菌絲分化成分生孢子梗，頂端串生分生孢子，呈白粉狀故名白粉菌。B、黑腐皮殼屬 （Valsa）子囊殼埋生子座基部，有長頸伸出子座；子囊孢子臘腸狀，單胞無色或暗色。子囊圓柱形，有頂環(huán)。為害植物主要是無性世代，在分生孢子盤上產(chǎn)生分生孢子。無性世代包括許多屬，如葉點菌屬Phyllosticta，莖點菌屬 Phoma，尾孢屬 Cercospora。無性世代不發(fā)生。④多胞銹菌屬（Phragmidium ）冬孢子 3 至多細(xì)胞，壁厚，表面光滑或有瘤狀突起，柄的基部膨大。黑粉菌分類主要以冬孢子的形狀、大小、有無不孕細(xì)胞、萌發(fā)的方式及冬孢子球的形態(tài)等。（2）分生孢子座（sporodochium）：很短的分生孢子梗聚集而成，墊狀或瘤狀，其上產(chǎn)生分生孢子?！颤S萎輪枝孢(棉黃萎病菌 )引起棉花黃萎病〕。 ⑥尾孢屬（Cercospora）分生孢子梗屈膝狀，青褐色至黑褐色，分生孢子多細(xì)胞，線形、鞭形至蠕蟲形。有的分生孢子盤四周或分生孢子梗之間具有黑色的剛毛。因此，徒手制片技術(shù)也是植物病理學(xué)研究的重要手段之一。10 / 66 2 刮：對病部病原體稀少，或用放大鏡也難辯認(rèn)霉層的病害標(biāo)本，可采用兩側(cè)具刀的三角刮針(或可用刀片代替)刮取病原物制片。 在毛毛雨天自田間取回感染白粉病的麥苗(或在保溫箱中取接種染病的麥苗)。同時雙手不應(yīng)緊靠身體，而是要活動自如。三、作業(yè)和思考題 1 每人交兩片符合質(zhì)量要求的玻片標(biāo)本。2 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA） 這種培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的分離和培養(yǎng) 成分：牛肉浸膏 3 克 蛋白胨 10 克 蔗糖 10 克 酵母浸膏 1 克 瓊脂 20 克 加水至 1000 毫升 方法：先將瓊脂加熱熔化于大部水中，再將其它各成分用少量水化開加入，調(diào)節(jié) pH至 7，趁熱用雙層紗布過濾，分裝，塞棉塞高壓滅菌。A. 培養(yǎng)基的分裝 ，外部太松B. 棉塞的做法 ，外部太短松此外，4 各組均制備 15 管試管裝和 2 瓶三角瓶裝的無菌水。 2 高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌，它的原理是利用高壓來提高蒸汽的溫度，達(dá)到滅菌的目的，其操作步驟如下： (1)關(guān)好排水閥門放入清水至標(biāo)度為止，注意水量一定要加足，否則容易造成事故。 (7)最后將高壓滅菌器內(nèi)的剩余水排出。病、健交接處，除材料新鮮，污染的可能性小外，病原菌的生活力強(qiáng)、比較活躍，容易分離成功。菌絲長出后轉(zhuǎn)至馬鈴薯瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 34 天后，無菌條件下鏡檢是否獲得純培養(yǎng)。17 / 66平板劃線操作示意圖三、實驗準(zhǔn)備 (一)清潔環(huán)境：分離工作嚴(yán)格說應(yīng)在無菌條下進(jìn)行，無菌室或無菌箱是分離不可缺少的設(shè)施。18 / 66四、思考題 1 分離植物病原菌常用的方法有幾種? 這些方法適用于分離哪類病原菌? 怎樣分離? 2 分離植物病原物時，為什么要選擇新鮮病材料，并且在病健交界處取樣? 沒有新鮮病材料怎么辦? 3 試分析分離工作成敗的原因。蓋在盛有少量蒸餾水的皿底上，保溫保濕培養(yǎng)，此法的優(yōu)點是簡便，而且適用于大量孢子萌發(fā)測定。 此法也可以直接在培養(yǎng)皿中做成的水瓊脂平板上進(jìn)行。 (三)芽管平均長度 即測定一定數(shù)目已萌發(fā)孢子的芽管長度，求其平均值。二、內(nèi)容、材料和方法 (一)拌土法(小麥根腐病) 拌土法適于土壤傳染的病害，方法是將消毒的土壤分別裝入兩個小花盆中，其中一盆表層覆以一厘米厚的菌土，菌土是用玉米砂培養(yǎng)菌 1 份加消毒土 5 份混合而成，另一盆不接種(不覆菌土)作為對照。 ：取切成適當(dāng)大小的白菜幫兩塊、經(jīng)水洗，待水稍干后，以 10%漂白粉溶液作表面消毒，分放在兩個滅過菌的上下鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用酒精擦過的玻璃棒順著白菜幫打三排不穿透的孔穴。三、接種試驗的觀察和記載 認(rèn)真觀察和記錄是做好接種試驗的重要環(huán)節(jié)，為了及時正確地分析總結(jié)試驗結(jié)果，必須認(rèn)真觀察并做詳盡的記錄，如記錄接種時間，接種植物、品種、接種方法、部位、接種用的病菌名稱(包括菌系和生理小種)、來源、繁殖和培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間)、接種體濃度、接種的方法和步驟及接種后的管理等?！　?二) 病害癥狀圖的繪制　　病害癥狀是植物根、莖、葉、花、果實等部位的變形、變色或穿孔等特征，這類標(biāo)本多不規(guī)則，繪制時只求表示出特征就行了，不象病原物形態(tài)圖那樣嚴(yán)格，也不必繪出原稿，再根據(jù)原稿描繪原圖，有的純以線條，有的線點結(jié)合，可根據(jù)自己得心應(yīng)手者繪之，雖然這樣說，但對初學(xué)者，先構(gòu)劃草圖，再反復(fù)修改推敲是必要的。四、思考題　1 每人提交合乎要求的病原物形態(tài)圖一張。不做特殊處理，一般光學(xué)顯微鏡是看不見的，鞭毛上沉積了染劑或銀鹽后才能看到，這是所有鞭毛染色的根據(jù)?！　 染色　　鞭毛染色的方法很多，大致可分為兩類，第一類是堿性品紅染色法；第二類是銀鹽沉積法，本次實驗用銀鹽沉積法或堿性品紅染色法。學(xué)會病原物標(biāo)本臨時玻片的制作方法?！　? 霜霉目(Peronosporales)　　霜霉目真菌與水霉目真菌的主要區(qū)別是藏卵器中只形成一個卵孢子；游動孢子沒有兩游現(xiàn)象，孢子囊一般是產(chǎn)生在特殊分化的孢囊梗上：孢子囊較易從孢囊梗上脫落?！　?5)假霜霉屬(Pseudoperonospora)　　觀察黃瓜霜霉病()標(biāo)本，注意為害部位和病狀特點，挑取霉層制片或取制備片 013)鏡檢孢囊梗和孢子囊，注意孢囊梗的分枝特點，與霜霉屬形態(tài)有何異同?！　? 根足霉屬(Rhizopus)　　根霉屬(Rhizopus)　　菌絲發(fā)達(dá)，有分枝，分布在基物表面或其內(nèi)，有匍匐絲和假根。三、作業(yè)繪根足霉形態(tài)圖四、思考題　　1．接合菌和鞭毛菌在形態(tài)上有哪些異同點?　　2．毛霉和根霉有什么不同?　　3．試談異宗配合的概念?！　?3)單絲殼屬(Sphaerotheca)　　觀察薔薇白粉病()標(biāo)本，注意癥狀特點，制片(或取制備片 13111)鏡檢閉囊殼及附屬絲，注意附屬絲是否為菌絲狀，閉囊殼內(nèi)子囊的數(shù)目等特點。44 / 66考慮到有些分目的特征難于掌握，界線并不很清楚，還有屬于末定的中間類型，所以不如45 / 66化繁為簡都?xì)w納入球殼目。47 / 66　　(1)長喙殼屬(Ceratocystis)　　取甘薯黑疤病()標(biāo)本，觀察癥狀特點，注意病斑是否凹陷?其上是否有毛刺狀物? 毛刺狀物為何物? 挑取毛刺狀物少許制片(或取其制備片 118)鏡檢，觀察子囊殼是否呈燒瓶狀? 啄的長度約為子囊殼直徑的幾倍?孔口上是否有口須?能否看見子囊孢子?形態(tài)如何? 為什么看不見子囊 ?　　(2)小叢殼屬 (Glomerella)　　取蘋果炭疽病()、菜豆炭疽病() 標(biāo)本，觀察癥狀特點，注意癥斑是否凹陷，其上是否有小黑點長出，小黑點為何物?有性階段在我國自然情況下很少發(fā)現(xiàn)，取蘋果炭疽病菌制備片鏡檢，觀察子囊的形態(tài)，著生部位，殼外是否有毛狀菌絲?能否見到子囊和子囊孢子。自丁香白粉病葉上挑取小黑點制片( 或取核桃白粉病菌制備片 141 或取丁香白粉病菌制備片 109)鏡檢閉囊殼和附屬絲，注意附屬絲頂端有數(shù)回二叉狀分枝，閉囊殼內(nèi)子囊多數(shù)的特點。二、內(nèi)容、材料和方法　(一)半子囊菌綱(Hemiasycetes)　　半子囊菌綱包括許多低等的子囊菌，比較原始，營養(yǎng)體是單細(xì)胞或不發(fā)達(dá)的菌絲體：子囊散生，不形成子囊果：也不產(chǎn)生真正的分生孢子，與植病關(guān)系較大的只有外囊菌目(Taphrinales)中的外囊菌屬(Taphrina)，該屬真菌都是專性寄生菌，引起葉片、枝梢和果實畸形?！　∪「适碥浉?)標(biāo)本，觀察癥狀特點，注意受害甘薯表面是否有白色毛狀物生出?在白色毛狀物中是否有黑點?挑取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的根足霉(帶少許培養(yǎng)基 )制片(或取制備片 022)，鏡檢小黑點是什么器官?注意匍匐枝和假根的形態(tài)，孢囊梗著生的位置，能否見到囊軸?什么形狀?　　毛霉屬(Mucor)　　無匍匐絲與假根，孢囊梗單生，直立，其它形態(tài)同根霉，挑取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的毛霉制片(或取制備片 020)，鏡檢孢囊梗，孢子囊和孢囊孢子，注意和根霉的區(qū)別。三、作業(yè)　　1．繪馬鈴薯晚疫病菌()和十字花科白銹病菌()孢囊梗和孢子囊形態(tài)圖?！　?)腐霉屬(Pythium)　　觀察蔬菜幼苗猝倒病標(biāo)本，注意受害部位和癥狀特點?！　?二)壺菌綱(Chytridiomycetes)　　壺菌營養(yǎng)體形態(tài)變化較大，較高等的開始有原始的絲狀體，無性繁殖產(chǎn)生后端具有單根尾鞭的游動孢子；有性繁殖最主要的方式是兩個同型的游動配子交配形成合子，重要的只有節(jié)壺菌屬(Physoderma)中的玉蜀黍節(jié)壺菌 ()引起玉米褐斑病?！　A性品紅染色法（Leifson賴夫生染色法）：的長方形小格，將載玻片斜放，用移植環(huán)在每小格頂端加一滴菌懸液，流下的菌懸液用紙吸去，干燥后，在第一個小格加5滴染劑，經(jīng)過5s，10s，15s后，分別在第二、三、四3個格中加滴染劑，仔細(xì)觀察染劑中有很細(xì)的沉淀物（鐵銹色云霧狀物）產(chǎn)生，當(dāng)?shù)谝弧⒌诙「褚旬a(chǎn)生沉淀時，立即用水洗去染劑，室溫下使載玻片干燥，然后直接在油鏡下鏡檢。為此所用載玻片一定要用特殊方法嚴(yán)格洗滌(方法這里從略 )，此外染劑處理時間一定要嚴(yán)格掌握處理時間，處理時間太短，鞭毛上沒有足夠的沉積物看不清楚；處理時間太長，玻片上沉積物太多，也看不清楚。　　(二) 植物病原細(xì)菌形態(tài)觀察和種類鑒定　　　培養(yǎng)性狀觀察　　取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的馬鈴薯環(huán)腐病菌() ，茄青枯病菌(Burkholderia solanacearum)和白菜軟腐病菌()等，注意觀察菌落顏色、大小、質(zhì)地，是否產(chǎn)生熒光色素等，和植物病原真菌培養(yǎng)菌落有什么根本性的不同?染色反應(yīng)觀察　　(1)革蘭氏染色反應(yīng)　　供試菌種：馬鈴薯環(huán)腐病菌() 和白菜軟腐病菌() ?！　?三) 曲線表的繪制　　曲線表以粗細(xì)，虛實不同的線條繪制，粗線用鴨嘴筆，細(xì)線用繪圖筆，一般座標(biāo)線直粗，曲線宜細(xì)，以使圖表重點分明，構(gòu)圖美觀，原圖大小應(yīng)比制版要求的大 1/2 左右。二、繪圖內(nèi)容、材料和方法