【正文】 粒。18 / 66四、思考題 1 分離植物病原菌常用的方法有幾種? 這些方法適用于分離哪類病原菌? 怎樣分離? 2 分離植物病原物時(shí)，為什么要選擇新鮮病材料，并且在病健交界處取樣? 沒(méi)有新鮮病材料怎么辦? 3 試分析分離工作成敗的原因。 (一)懸滴法 1 材料：玉米大斑病菌斜面菌種。蓋在盛有少量蒸餾水的皿底上，保溫保濕培養(yǎng)，此法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，而且適用于大量孢子萌發(fā)測(cè)定。 (三)瓊脂培養(yǎng)基法 對(duì)于某些不適于直接在水滴中萌發(fā)的真菌可采用此法。 此法也可以直接在培養(yǎng)皿中做成的水瓊脂平板上進(jìn)行。滅菌后皿底加少許滅菌水，將濾紙條橫放在載玻片上，崩緊，兩端拖入水中，吸滴水，再在紙上滴一滴玉米瘤黑粉病菌黑粉孢子懸浮液，蓋上皿蓋，在 25℃溫箱中培養(yǎng)，逐日檢查萌發(fā)的結(jié)果。 (三)芽管平均長(zhǎng)度 即測(cè)定一定數(shù)目已萌發(fā)孢子的芽管長(zhǎng)度，求其平均值。因此，接種是植病工作者必須掌握的基本技術(shù)環(huán)節(jié)。二、內(nèi)容、材料和方法 (一)拌土法(小麥根腐病) 拌土法適于土壤傳染的病害，方法是將消毒的土壤分別裝入兩個(gè)小花盆中，其中一盆表層覆以一厘米厚的菌土，菌土是用玉米砂培養(yǎng)菌 1 份加消毒土 5 份混合而成，另一盆不接種(不覆菌土)作為對(duì)照。(三)涂抹法(小麥稈銹病) 這也是氣流傳播的病害常用的接種方法，用于禾本科銹病接種。 ：取切成適當(dāng)大小的白菜幫兩塊、經(jīng)水洗，待水稍干后，以 10%漂白粉溶液作表面消毒，分放在兩個(gè)滅過(guò)菌的上下鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，用酒精擦過(guò)的玻璃棒順著白菜幫打三排不穿透的孔穴。以免流出孔穴，另一培養(yǎng)皿的菜幫以同法處理作為重復(fù)。三、接種試驗(yàn)的觀察和記載 認(rèn)真觀察和記錄是做好接種試驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，為了及時(shí)正確地分析總結(jié)試驗(yàn)結(jié)果，必須認(rèn)真觀察并做詳盡的記錄，如記錄接種時(shí)間，接種植物、品種、接種方法、部位、接種用的病菌名稱(包括菌系和生理小種)、來(lái)源、繁殖和培養(yǎng)方法(培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間)、接種體濃度、接種的方法和步驟及接種后的管理等。　　　　將硫酸紙蒙于初稿上描繪，在用鉛筆時(shí)，筆頭必須削尖，輕描以便修改和保持圖面清晰，橡皮要軟而不帶顏色，以免沾污畫(huà)面。　　(二) 病害癥狀圖的繪制　　病害癥狀是植物根、莖、葉、花、果實(shí)等部位的變形、變色或穿孔等特征，這類標(biāo)本多不規(guī)則，繪制時(shí)只求表示出特征就行了，不象病原物形態(tài)圖那樣嚴(yán)格，也不必繪出原稿，再根據(jù)原稿描繪原圖，有的純以線條，有的線點(diǎn)結(jié)合，可根據(jù)自己得心應(yīng)手者繪之，雖然這樣說(shuō)，但對(duì)初學(xué)者，先構(gòu)劃草圖，再反復(fù)修改推敲是必要的。點(diǎn)要點(diǎn)得圓，點(diǎn)得勻，點(diǎn)子的排列，要保持整齊、均勻，均勻中求變化，在變化中間要統(tǒng)一，所以應(yīng)有計(jì)劃(心中有數(shù)) 地從明處點(diǎn)起，小心而慢慢的點(diǎn)，一行行交互著點(diǎn)，不要等到畫(huà)好看得太疏而再加點(diǎn)子，再加的點(diǎn)子反而會(huì)變得不均勻，明的部分，色淡的部分點(diǎn)子小些稀些，暗的部分，色深的部分點(diǎn)子要大些密些。四、思考題　1 每人提交合乎要求的病原物形態(tài)圖一張?！　 染色步驟 (染色劑配法見(jiàn)附3)　　a 滴草酸銨結(jié)晶紫液于涂片上，染色1分鐘；　　b 傾去染液，水洗(亦可不用水洗)；　　c 加碘液處理1分鐘；　　d 傾去碘液、水洗、吸水紙吸干； 　　e 用95% 酒精洗脫染液，時(shí)間約30秒鐘；　　f 吸干后，滴加復(fù)染劑藏紅〇復(fù)染10—30秒鐘；　　g 水洗、吸干鏡檢。不做特殊處理，一般光學(xué)顯微鏡是看不見(jiàn)的，鞭毛上沉積了染劑或銀鹽后才能看到，這是所有鞭毛染色的根據(jù)?！　」┰嚲辏喊撞塑浉【?)　　操作步驟：　　A 載玻片準(zhǔn)備　　用新的載玻片，經(jīng)過(guò)系列清潔處理(方法從略) 后，進(jìn)行檢驗(yàn)，合格者用于實(shí)驗(yàn)?！　 染色　　鞭毛染色的方法很多，大致可分為兩類，第一類是堿性品紅染色法；第二類是銀鹽沉積法，本次實(shí)驗(yàn)用銀鹽沉積法或堿性品紅染色法。3．使用二甲苯擦鏡頭時(shí)，注意二甲苯不能過(guò)多，以防溶解固定透鏡的樹(shù)脂。學(xué)會(huì)病原物標(biāo)本臨時(shí)玻片的制作方法?！　?三)卵菌綱(Oomycetes)　　卵菌的特征是營(yíng)養(yǎng)體為真正的菌絲體；無(wú)性繁殖產(chǎn)生具有一根尾鞭和一根茸鞭的游動(dòng)孢子，有性繁殖通過(guò)異型的雄器和藏卵器交配產(chǎn)生卵孢子，根據(jù)藏卵器內(nèi)卵孢子數(shù)目的多少及其他特性，卵菌綱分為水霉目和霜霉目?jī)蓚€(gè)目?！　? 霜霉目(Peronosporales)　　霜霉目真菌與水霉目真菌的主要區(qū)別是藏卵器中只形成一個(gè)卵孢子；游動(dòng)孢子沒(méi)有兩游現(xiàn)象，孢子囊一般是產(chǎn)生在特殊分化的孢囊梗上：孢子囊較易從孢囊梗上脫落。觀察菌絲有沒(méi)有隔膜?游動(dòng)孢子囊形狀?與菌絲差別是否明顯?能否看到孢子囊萌發(fā)的情景?泄管和泡囊的形態(tài)如何? 　　2)疫霉屬(Phytophthora) 　　取馬鈴薯晚疫病()標(biāo)本，觀察受害部位?！　?5)假霜霉屬(Pseudoperonospora)　　觀察黃瓜霜霉病()標(biāo)本，注意為害部位和病狀特點(diǎn)，挑取霉層制片或取制備片 013)鏡檢孢囊梗和孢子囊，注意孢囊梗的分枝特點(diǎn)，與霜霉屬形態(tài)有何異同?！　?．鏡檢鑒定大蔥霜霉病、向日葵霜霉病，波菜霜霉病的病原菌，鑒定到屬?！　? 根足霉屬(Rhizopus)　　根霉屬(Rhizopus)　　菌絲發(fā)達(dá)，有分枝，分布在基物表面或其內(nèi)，有匍匐絲和假根。通常形成小型孢子囊，小型孢子囊聚生在孢子囊梗頂端膨大的頭狀體的小梗上，其中形成一個(gè)孢子，故也稱這種小型孢子囊為分生孢子。三、作業(yè)繪根足霉形態(tài)圖四、思考題　　1．接合菌和鞭毛菌在形態(tài)上有哪些異同點(diǎn)?　　2．毛霉和根霉有什么不同?　　3．試談異宗配合的概念?！　?二) 不整囊菌綱(Plectomycetes)　　(三) 核菌綱(Pyrenomycetes)　　　　1 白粉菌目 Erysiphales　　白粉菌都是專性寄生菌，菌絲、無(wú)性和有性繁殖體多表生，以吸器伸入寄主表皮細(xì)胞吸取養(yǎng)分，子囊果為閉囊殼，其上生有各種形狀的附屬絲，根據(jù)附屬絲的性狀和閉囊殼內(nèi)33 / 66子囊的數(shù)目進(jìn)行分類，常見(jiàn)的有以下七屬?！　?3)單絲殼屬(Sphaerotheca)　　觀察薔薇白粉病()標(biāo)本，注意癥狀特點(diǎn)，制片(或取制備片 13111)鏡檢閉囊殼及附屬絲，注意附屬絲是否為菌絲狀，閉囊殼內(nèi)子囊的數(shù)目等特點(diǎn)?！　?6)球針殼囊 (Phyllactinia)　　取桑里白粉病()和梨白粉病標(biāo)本觀察癥狀特點(diǎn)，并制片(或取制備片)鏡檢附屬絲的形態(tài)，注意附屬絲生在閉囊殼的赤道部位，剛直，基部膨大呈球形，閉囊殼內(nèi)子囊多個(gè)。44 / 66考慮到有些分目的特征難于掌握，界線并不很清楚，還有屬于末定的中間類型，所以不如45 / 66化繁為簡(jiǎn)都?xì)w納入球殼目?！　?4)綠核菌屬 (擬黑粉菌屬，Ustilaginoi。47 / 66　　(1)長(zhǎng)喙殼屬(Ceratocystis)　　取甘薯黑疤病()標(biāo)本，觀察癥狀特點(diǎn)，注意病斑是否凹陷?其上是否有毛刺狀物? 毛刺狀物為何物? 挑取毛刺狀物少許制片(或取其制備片 118)鏡檢，觀察子囊殼是否呈燒瓶狀? 啄的長(zhǎng)度約為子囊殼直徑的幾倍?孔口上是否有口須?能否看見(jiàn)子囊孢子?形態(tài)如何? 為什么看不見(jiàn)子囊 ?　　(2)小叢殼屬 (Glomerella)　　取蘋果炭疽病()、菜豆炭疽病() 標(biāo)本，觀察癥狀特點(diǎn)，注意癥斑是否凹陷，其上是否有小黑點(diǎn)長(zhǎng)出，小黑點(diǎn)為何物?有性階段在我國(guó)自然情況下很少發(fā)現(xiàn)，取蘋果炭疽病菌制備片鏡檢，觀察子囊的形態(tài)，著生部位，殼外是否有毛狀菌絲?能否見(jiàn)到子囊和子囊孢子。39 / 66　　2 球殼目(Sphaeriales)40 / 66　　球殼目真菌的子囊果為真正的子囊殼，有真正的孔口，孔口乳突狀或長(zhǎng)筒狀，子囊有41 / 66圓形、棍棒形、紡錘形，一般排列成子實(shí)層，子囊間大都有側(cè)絲，也有的早期消解或沒(méi)有，42 / 66球殼菌一般都有很發(fā)達(dá)的分生孢子階段。自丁香白粉病葉上挑取小黑點(diǎn)制片( 或取核桃白粉病菌制備片 141 或取丁香白粉病菌制備片 109)鏡檢閉囊殼和附屬絲，注意附屬絲頂端有數(shù)回二叉狀分枝，閉囊殼內(nèi)子囊多數(shù)的特點(diǎn)?！　?2)布氏白粉屬(Blumeria)　　該屬是從白粉屬(Erysiphe)劃出來(lái)的一個(gè)新屬，主要特征是閉囊殼上的菌絲狀附屬絲很短，閉囊殼內(nèi)有多個(gè)子囊，分生孢子?；颗虼蟪式蛐?。二、內(nèi)容、材料和方法　(一)半子囊菌綱(Hemiasycetes)　　半子囊菌綱包括許多低等的子囊菌，比較原始，營(yíng)養(yǎng)體是單細(xì)胞或不發(fā)達(dá)的菌絲體：子囊散生，不形成子囊果：也不產(chǎn)生真正的分生孢子，與植病關(guān)系較大的只有外囊菌目(Taphrinales)中的外囊菌屬(Taphrina)，該屬真菌都是專性寄生菌，引起葉片、枝梢和果實(shí)畸形?！　±珙^霉屬(Absidia)　　產(chǎn)生匍匐絲和假根，孢囊梗自假根間的弓形匍匐絲上長(zhǎng)出，配囊柄上長(zhǎng)出附屬絲包圍32 / 66接合孢子?！　∪「适碥浉?)標(biāo)本，觀察癥狀特點(diǎn)，注意受害甘薯表面是否有白色毛狀物生出?在白色毛狀物中是否有黑點(diǎn)?挑取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的根足霉(帶少許培養(yǎng)基 )制片(或取制備片 022)，鏡檢小黑點(diǎn)是什么器官?注意匍匐枝和假根的形態(tài)，孢囊梗著生的位置，能否見(jiàn)到囊軸?什么形狀?　　毛霉屬(Mucor)　　無(wú)匍匐絲與假根，孢囊梗單生，直立，其它形態(tài)同根霉，挑取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的毛霉制片(或取制備片 020)，鏡檢孢囊梗，孢子囊和孢囊孢子，注意和根霉的區(qū)別。　　2．霜霉為害植物時(shí)，為什么多發(fā)生在葉部?為什么多在病斑背面形成霉層?為什么常在低溫多濕的條件下受害嚴(yán)重.31 / 66實(shí)訓(xùn)三　接合菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)　　熟悉與植病關(guān)系密切的接合菌的形態(tài)及其所致病害的癥狀特點(diǎn)，同時(shí)觀察真菌的異宗配合現(xiàn)象。三、作業(yè)　　1．繪馬鈴薯晚疫病菌()和十字花科白銹病菌()孢囊梗和孢子囊形態(tài)圖?！　?3)單軸霉屬(Plasmopara)　　觀察葡萄霜霉病()標(biāo)本，注意為害部位及癥狀特點(diǎn)，挑取葡萄霉病病葉病斑上的霉層制片(或取制備片 015)鏡檢孢子囊梗的形態(tài)，注意分枝特點(diǎn)及分枝末端的特征?！　?)腐霉屬(Pythium)　　觀察蔬菜幼苗猝倒病標(biāo)本，注意受害部位和癥狀特點(diǎn)?！　?)水霉屬(Saprolegnia)　　鏡檢培養(yǎng)皿中用線麻籽或大米粒誘發(fā)培養(yǎng)的水霉菌，注意菌絲和游動(dòng)孢子27 / 66囊的形態(tài)，菌絲和游動(dòng)孢子囊區(qū)別是否明顯?次生游動(dòng)孢子囊是否從初生游動(dòng)孢28 / 66子囊的空殼內(nèi)生出(層生)?藏卵器內(nèi)卵孢子數(shù)是一個(gè)，還是多個(gè)；能否看到藏卵29 / 66器和雄器交配?能否看到游動(dòng)孢子釋放的現(xiàn)象?！　?二)壺菌綱(Chytridiomycetes)　　壺菌營(yíng)養(yǎng)體形態(tài)變化較大，較高等的開(kāi)始有原始的絲狀體，無(wú)性繁殖產(chǎn)生后端具有單根尾鞭的游動(dòng)孢子；有性繁殖最主要的方式是兩個(gè)同型的游動(dòng)配子交配形成合子，重要的只有節(jié)壺菌屬(Physoderma)中的玉蜀黍節(jié)壺菌 ()引起玉米褐斑病。實(shí)訓(xùn)二鞭毛菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀察一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)、壺菌綱和卵菌綱真菌的主要形態(tài)特征，掌握與植物病害有關(guān)的重要屬的基本形態(tài)特征、分類依據(jù)及其所致病害的癥狀特點(diǎn)?！　A性品紅染色法（Leifson賴夫生染色法）：的長(zhǎng)方形小格，將載玻片斜放，用移植環(huán)在每小格頂端加一滴菌懸液，流下的菌懸液用紙吸去，干燥后，在第一個(gè)小格加5滴染劑，經(jīng)過(guò)5s，10s，15s后，分別在第二、三、四3個(gè)格中加滴染劑，仔細(xì)觀察染劑中有很細(xì)的沉淀物（鐵銹色云霧狀物）產(chǎn)生，當(dāng)?shù)谝?、第二小格已產(chǎn)生沉淀時(shí)，立即用水洗去染劑，室溫下使載玻片干燥，然后直接在油鏡下鏡檢。在已活化并在16—28℃恒溫箱中培養(yǎng)16—18小時(shí)的白菜軟腐病菌斜面上加3—5毫升先在恒溫箱中經(jīng)予熱的無(wú)菌水，靜置10—20分鐘，使細(xì)菌游出配成稀薄的菌懸液，注意靜置的時(shí)間不能太長(zhǎng)，因?yàn)闀r(shí)間長(zhǎng)了鞭毛可能脫落、染色固定前可在鏡下觀察其游動(dòng)性。為此所用載玻片一定要用特殊方法嚴(yán)格洗滌(方法這里從略 )，此外染劑處理時(shí)間一定要嚴(yán)格掌握處理時(shí)間，處理時(shí)間太短，鞭毛上沒(méi)有足夠的沉積物看不清楚；處理時(shí)間太長(zhǎng)，玻片上沉積物太多，也看不清楚。否則是紅是紫不易區(qū)分?！　?二) 植物病原細(xì)菌形態(tài)觀察和種類鑒定　　　培養(yǎng)性狀觀察　　取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的馬鈴薯環(huán)腐病菌() ，茄青枯病菌(Burkholderia solanacearum)和白菜軟腐病菌()等，注意觀察菌落顏色、大小、質(zhì)地，是否產(chǎn)生熒光色素等，和植物病原真菌培養(yǎng)菌落有什么根本性的不同?染色反應(yīng)觀察　　(1)革蘭氏染色反應(yīng)　　供試菌種：馬鈴薯環(huán)腐病菌() 和白菜軟腐病菌() 。筆尖含黑的多少，壓筆力的大小，常引起線點(diǎn)的粗細(xì)變化，要多加體會(huì)運(yùn)用?！　?三) 曲線表的繪制　　曲線表以粗細(xì)，虛實(shí)不同的線條繪制，粗線用鴨嘴筆，細(xì)線用繪圖筆，一般座標(biāo)線直粗，曲線宜細(xì)，以使圖表重點(diǎn)分明，構(gòu)圖美觀，原圖大小應(yīng)比制版要求的大 1/2 左右?！　D上要有比例尺，以表示各部的大小，圖下要寫名稱和標(biāo)圖注。二、繪圖內(nèi)容、材料和方法　　(一) 病原菌形態(tài)圖的繪制　　以點(diǎn)線法繪制黑白圖的步驟和方法　　　　用普通白紙、鉛筆(1H) 起稿，先確定圖幅大小，一般要比制版尺寸大一些，但不能超22 / 66過(guò)一倍，制版時(shí)再縮小，有提高原圖質(zhì)量的效果，當(dāng)然如能精良繪制，亦可原圖制版，如在一張圖上繪出幾個(gè)內(nèi)容，如分生孢子梗和分生孢子子囊殼，子囊和子囊孢子，則應(yīng)按圖幅大小求出初稿上各部比例尺寸，其比例大小需按顯微測(cè)微尺度量算出。 ：取白梨以酒精火焰表面消毒后，用熾熱的解剖刀，在其