【正文】 玫瑰銹病]。[亞麻柵銹菌（）引起亞麻銹菌病]。引起園藝植物的病害有：茭白黑粉病、慈。病害主要通過土壤中的菌核、菌絲或菌索進(jìn)行傳播和蔓延。（3）分生孢子器（pyidium）：分生孢子器（pyidium）：球形、近球形、瓶狀或不規(guī)則形的子實(shí)體，具孔口，孢子梗聚生其內(nèi)。分生孢子串生，單胞無色。③青霉屬(Penicillium )分生孢子梗直立，頂端一至多次分枝，形成掃帚狀。[灰葡萄孢()引起多種植物灰霉病。如花生褐斑病、菜豆紅斑病、豇豆煤霉病等。⑧鐮孢霉屬(Fusarium )大型分生孢子多細(xì)胞，鐮刀型；小型分生孢子單細(xì)胞，橢圓形至卵圓形。黑盤孢目真菌引起的病害如蘋果褐斑病、蘋果、辣椒、茄子、黃瓜棉花等的炭疽病等。（4）無孢菌:除產(chǎn)生厚垣孢子外，不產(chǎn)生任何其它孢子。通過本次實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)學(xué)習(xí)實(shí)踐常用的徒手制片技術(shù)，為普通植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)的深入學(xué)習(xí)以及以后開展病理學(xué)的有關(guān)研究工作奠定堅(jiān)實(shí)的制片技術(shù)基礎(chǔ)。常用的方法的概括為挑、刮、撥、撕四種。刮的方法是，用刮針的一刃，蘸浮載劑少許，在病部順同一個(gè)方向刮取 2—3 次，將刮得的病原蘸在載玻片的浮載劑中封片鏡檢。如子囊殼、分生孢子器、閉囊殼等，可將病原體連同寄主組織一同撥下，放入浮載劑中，用兩支解剖針，一支穩(wěn)定材料，另一支撥出植物組織，使病原體外露制片。用刀片割破葉背表皮再用小鑷子輕輕撕下，放在浮載劑中制片鏡檢白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形態(tài)。右手握穩(wěn)刀，從左向右后方斜向切割。用臂力均勻地沿刀口后部起拉向前方，連續(xù)切割 4—5 片后，用毛筆蘸水輕輕沿刀口取下，放入盛有水的淺玻皿中，在此過程中左手握著的材料不要放下，否則再切時(shí)難按原位置拿材料，此外，在切片過程中，必須常用毛筆蘸水濕潤(rùn)材料，以免材料干涸不便切割。 切割一定數(shù)量的薄片后，用移置環(huán)在淺玻皿中選取合用的材料薄片，放在載玻片的水11 / 66滴中，鏡檢合格者即酒精燈上將水烘干并擺正材料，然后加一滴乳酚油或其浮載劑；放在展片臺(tái)上略加熱，鏡檢如無氣泡，即可小心加蓋片，用吸水紙吸除多余的浮載劑，最后貼好標(biāo)簽，平放于切片板上，待干燥適宜時(shí)封固。 2 整體封藏法和徒手切片法兩種基本徒手制片技術(shù)都在什么情況下使用? 徒手切法制片有什么優(yōu)缺點(diǎn)? 怎樣解決這種方法本身存在的問題?2－2 培養(yǎng)基的配制和滅菌一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 微生物的生長(zhǎng)發(fā)育都有一定的營(yíng)養(yǎng)需要，培養(yǎng)基即人工培養(yǎng)微生物、為其生長(zhǎng)發(fā)育提供所需營(yíng)養(yǎng)的基質(zhì)。 成分：馬鈴薯 200 克 蔗 糖 10 克 瓊 脂 20 克 加水至 1000 毫升 方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水煮沸半小時(shí)，用雙層紗布濾去薯塊，補(bǔ)足水量，加入瓊脂，加熱熔化，再加糖，待完全化后，乘熱用雙層紗布過濾分裝，塞好棉塞高壓滅菌。 牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易稱重，稱重時(shí)用小燒杯盛裝，以玻璃棒沾取，故要先稱好杯和棒的重量后，再開始沾取浸膏稱重，稱后將杯和棒上粘著的浸膏洗凈于鍋中。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培養(yǎng)基和溴百里酚藍(lán)或其它指示劑 1—2 滴，根據(jù)顏色反應(yīng)，在所配的培養(yǎng)液中加入少量 lN 的NaOH 或 HCl，然后再取樣測(cè)定，如此反復(fù)多次，達(dá)到所需求的反應(yīng)為止。 (二)培養(yǎng)基的滅菌 為了得到某種病原物的純培養(yǎng)，配好的培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌才能使用，滅菌是指用物理或化學(xué)方法完全殺死器物表面及其內(nèi)部的所有微生物，滅菌與消毒的概念不同，消毒則是指消滅器物或植物組織表面的某些微生物(能常稱雜菌)，而不是消滅所有的微生物。 (3)關(guān)緊箱門，打開排氣孔接上電源。 (2)將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅菌鍋中，關(guān)上器蓋，旋緊螺旋時(shí)，先將每個(gè)螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度(不要太緊)，然后再旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺旋，以達(dá)到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達(dá)不到徹底滅菌的目的。 (5)稍微打開一點(diǎn)排氣活門，使鍋內(nèi)蒸氣緩慢排除，然后逐漸開大活門，氣壓徐徐下降，注意勿使排氣過快，否則會(huì)使鍋內(nèi)的培養(yǎng)基沸騰而沖脫或沾濕棉花塞，但排氣太慢又使培養(yǎng)基在鍋內(nèi)，受高溫處理時(shí)間過長(zhǎng)，這樣對(duì)培養(yǎng)基也是不利的。 (8)抽取上述滅菌的培養(yǎng)基，放入 25℃溫箱中，48 小時(shí)后不見雜菌生出，便證明培養(yǎng)基已達(dá)到滅菌目的，可以使用。分離和培養(yǎng)是植病實(shí)驗(yàn)室最基本的操作技術(shù)之一。 (二)分離方法 病原菌分離的方法因材料不同而異，植病實(shí)驗(yàn)室最常見的方法有組織分離法和稀釋分離法兩種。用 10%漂白粉（次氯酸鈣）溶液消毒（漂白粉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）35min，時(shí)間長(zhǎng)短依病組織不同而異，然后直接移至 PSA 平板培養(yǎng)基上(為防止細(xì)菌污染，可在培養(yǎng)基中加入 1000ppm 鏈霉素 10 毫升)，倒置于 20—25℃室溫下，待菌落長(zhǎng)出后挑取前緣菌絲，回接于 PSA 斜面培養(yǎng)基上，在 25℃溫箱中培養(yǎng)，待菌落顏色變深后，在無菌條件下鏡檢是否是玉米大斑病菌，弱僅有玉米大斑病菌的孢子，則說明已獲得了純培養(yǎng)，否則，則需要繼續(xù)轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)。 ：稀釋分離法適用于細(xì)菌、土壤菌及產(chǎn)生孢子多的真菌等病原菌的分離，16 / 66本次實(shí)驗(yàn)以白菜軟腐病作為材料進(jìn)行分類離。 以上分離實(shí)驗(yàn)也可以劃線法進(jìn)行，方法是先取兩付滅菌培養(yǎng)皿，每皿倒入約 15 毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，沿桌面輕輕搖勻，制成平板，然后用移置環(huán)沾取一環(huán)稀釋好的菌懸液，在第一個(gè)培養(yǎng)皿平面培養(yǎng)基的左方長(zhǎng)方形區(qū)內(nèi)劃平行線 5—7 條，再以此移置環(huán)繼續(xù)向右(和左方小區(qū)內(nèi)的幾條平行線成一定角度)劃 5—7 條平行線，依此法劃兩皿，倒置于26—28℃溫箱中培養(yǎng)，1—2 日后挑單個(gè)典型菌落移到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)待用。若限于條件實(shí)驗(yàn)只能在普通房間進(jìn)行時(shí)，必須對(duì)房間進(jìn)行徹底掃除，清潔環(huán)境、搞好衛(wèi)生。 玉米大斑病病葉 1 片。2－4 真菌孢子的萌發(fā) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 欲了解病菌生活力的強(qiáng)弱，生存期的長(zhǎng)短，有效傳播距離，抗藥性的大小，生活史，環(huán)境與發(fā)病的關(guān)系以及有些病菌的種類鑒定等，都必須進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)。 2 方法：在潔凈的蓋玻片中央滴玉米大斑病菌孢子懸浮液一滴，注意滴成圓形，大小適當(dāng)，菌懸液濃度以顯微鏡低倍鏡頭每個(gè)視野約 20 個(gè)孢子為宜。 (二)液滴法 ：小麥根腐病菌斜面菌種。 ：新采集的帶有夏孢子堆的小麥稈銹病病葉或小麥白粉病病葉。 (四)載片引濕法 此法用于不適于直接在水滴中萌發(fā)的某些真菌。三、孢子萌發(fā)的記載方法孢子萌發(fā)是先吸水膨脹，然后長(zhǎng)出芽管，通常以芽管長(zhǎng)度超過孢子直徑一半(不是正圓形的孢子以短徑為準(zhǔn))作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，記載萌發(fā)的方法有以下幾種。 此外，有些萌發(fā)試驗(yàn)，如藥效測(cè)定等，還需注意記錄芽管的寬度形狀變化以及是否有分枝等。 植物病害人工接種方法，是根據(jù)病害的傳染方式和侵染途徑設(shè)計(jì)的，植物病害的種類很多、其傳染方式和侵染途徑各異。將經(jīng) %升汞表面消毒 3 分鐘并用無菌水洗 3 次的小麥種子，分別播種在兩個(gè)花盆內(nèi)，插上標(biāo)牌，注明接種日期，方法病害名稱及接種人姓名，花盆放在室溫下，澆水保濕，遮陰管理，待幼苗出土展開葉子后(大約一周)，觀察并記載根腐病發(fā)生情況。方法是用姆指沾銹菌夏孢子懸液自下向上輕輕涂欲接種的小麥葉片，也可先用手指沾水摩擦葉片，使葉表有一層水膜，然后將夏孢子粉抹在上面，以不涂抹孢子懸液或孢子粉的作為對(duì)照。將培養(yǎng)好的白菜軟腐病菌斜面菌種的菌苔以無菌水洗下作成菌懸液。蓋好皿蓋，置于 26—28℃的溫箱中，24 小時(shí)后檢查發(fā)病情況。 四、思考題 植物接種常用的方法有哪些? 舉例說明如何根據(jù)病害特點(diǎn)選擇接種方法?2－6 植物病原生物繪圖技術(shù)一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo) 提高生物繪圖技術(shù)水平，為今后開展病理學(xué)有關(guān)工作奠定較好的基礎(chǔ)?！　　　∮美L圖筆蘸碳素黑水照原稿線條描出全部線條輪廓，然后根據(jù)病原菌各部有無顏色，顏色深淺等特點(diǎn)，用黑點(diǎn)的有無及疏密程度點(diǎn)出，使之具有色調(diào)，質(zhì)地及立體之感。繪圖時(shí)照顧各部分比例是必不可少的，同樣，圖繪完后要注明病害名稱和標(biāo)注圖注。　?。簞澗€是繪圖的又一基本功，一般以肘貼桌面，掌側(cè)和小指抵圖紙，緊握筆桿，從左下向右上的方向運(yùn)筆，同時(shí)應(yīng)閉氣用力，可使線條均勻、光滑、流暢，一般說，不應(yīng)露出筆尖起落的痕跡?！? 病原物形態(tài)圖的繪制，一般經(jīng)過哪幾個(gè)步驟? 如何很好完成這些繪圖步驟? 每一步都應(yīng)注哪些問題? 第三部分微生物病理技能訓(xùn)練實(shí)訓(xùn)一 植物病原細(xì)菌觀察一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)植物病原細(xì)菌形態(tài)觀察和種類鑒定二、內(nèi)容、材料和方法　(一)植物細(xì)菌病害的簡(jiǎn)易診斷　　取水稻白葉枯病新病葉，在病斑病健交界處剪取22 mm 的小塊病組織，放在載玻片上，滴加一滴蒸餾水，蓋好蓋玻片后，立即在顯微鏡下觀察，注意葉組織維管束剪斷處是否有大量的細(xì)菌，呈云霧狀溢出，如將視野調(diào)暗觀察更易見到，按同樣方法用健康組織作鏡檢反證?！　￡栃苑磻?yīng)的細(xì)菌染成紫色，陰性反應(yīng)的染成紅色，注意涂片菌液不能太濃，其次褪色要徹底。但是染劑也可以在載玻片上沉積，如果載玻上沉積染劑太多，就會(huì)影響鞭毛染色效果?！　 細(xì)菌懸液的配制　　供染色用的菌種，用前每隔1—2天轉(zhuǎn)移一次，連續(xù)轉(zhuǎn)移幾次進(jìn)行活化，增強(qiáng)細(xì)菌的活性。銀鹽沉積法：滴甲液3—5分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗甲液，再加乙液，處理30—60秒鐘，立即用蒸餾水輕輕沖洗乙液，空氣中自然干燥后，鏡檢(有人在加乙液后，在燈焰上微加熱，再用水洗)菌體染成深褐色，鞭毛染成褐色，注意鞭毛數(shù)目及著生方式。4．注意保持顯微鏡的潔凈，對(duì)金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。二、內(nèi)容、材料和方法　　(一)根腫菌綱(Plasmodiophoromycetes) 　　1 根腫菌屬(Plasmodiophora)　　觀察白菜根腫病()的液浸標(biāo)本，注意根腫的特點(diǎn)，然后鏡檢白菜根腫病菌制備片(001)，注意在寄主細(xì)胞內(nèi)能否見到成堆的休眠孢子 ?受病細(xì)胞的大小與正常細(xì)胞有無區(qū)別?是薄壁細(xì)胞受害，還是輸導(dǎo)組織受害 ? 　　2 粉痂屬(Spongospora) 　　觀察馬鈴薯粉痂病()標(biāo)本，鏡檢該病的制備片 (002)，注意馬鈴薯塊莖皮層上形成的瘡痂狀小瘤及寄主細(xì)胞內(nèi)由休眠孢子聚集成多孔的海綿狀圓球?！　? 水霉目(Saprolegniales)　　水霉目真菌的主要特征是藏卵器中形成一個(gè)以上的卵孢子；游動(dòng)孢子有兩游現(xiàn)象，游動(dòng)孢子囊(菌絲頂端原生質(zhì)高度濃縮，基部有分隔與菌絲分開 )不脫落，與菌絲無顯著差異，該目與植物病害關(guān)系較大的有以下兩屬。　　根據(jù)孢囊梗的形態(tài)特點(diǎn)，霜霉目分為腐霉菌科(Pythiaceae)、白銹菌科(Albuginaceae)和霜霉菌科(Peronosporaceae)(見附錄)，該目與植病關(guān)系密切的有以下幾個(gè)屬。注意癥狀特點(diǎn)，特別要注意葉片上病斑的位置，大小、狀態(tài)、顏色，邊緣是否清楚，是否產(chǎn)生灰白色的霉層(特別是葉背面)?挑取馬鈴薯晚疫病菌斜面培養(yǎng)菌制片(或取制備片 008)鏡檢游動(dòng)孢囊梗、游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子，注意孢囊梗分枝的特點(diǎn)及游動(dòng)孢子囊的形態(tài)?！　?6)盤梗霉屬(Bremia)　　觀察萵苣霜霜霉病()標(biāo)本，注意癥狀特點(diǎn)，挑取病葉上的霉層制片(或取制備片 016)，鏡檢孢子囊梗的形態(tài)，注意分枝末端是否膨大呈盤狀?邊緣是否有小梗?孢子囊的形態(tài)及著生位置如何?　　7)白銹菌屬(Albugo)　　取十字花科白銹病()，注意受害部位，癥狀特點(diǎn)，切取白銹病病葉制片鏡檢(或鏡檢制備片 009—無性，010—有性)，注意孢子囊梗著生的位置，形態(tài)和排列特點(diǎn)，孢子囊的形態(tài)，注意觀察藏卵器內(nèi)卵孢子的數(shù)目，藏卵器壁與卵孢子壁是否愈合，另取該菌無性世代制備片 009，觀察孢子囊梗的形態(tài)，特別要注意分枝特點(diǎn)。四、思考題　　1．試比較說明水霉、腐霉、疫霉和霜霉，從低級(jí)向高級(jí)演化的情況。孢囊梗 23 根叢生，在假根相反方向從菌絲上產(chǎn)生，一般不分枝，頂生孢子囊，產(chǎn)生大量孢囊孢子，有囊軸，鑼錘形，孢囊孢子單胞，表面有飾紋，接合孢子色深，表面有瘤狀突起。該菌為害花和果實(shí)，引起花腐和果腐，取制備片 024，鏡檢笄霉的孢囊梗和孢子囊形態(tài)，注意觀察該屬與根霉、毛霉的區(qū)別。實(shí)訓(xùn)四子囊菌亞門真菌及其所致病害癥狀觀　　 一、實(shí)訓(xùn)目標(biāo)　　通過本次實(shí)驗(yàn)了解子囊菌的形態(tài)特征及分類概況，熟悉該菌所致病害的癥狀特點(diǎn)，以便為子囊菌的分類和病害鑒定打下基礎(chǔ)。34 / 66　　(1)白粉屬(Erysiphe)35 / 66　　觀察瓜類白粉病()標(biāo)本，注意病狀特點(diǎn)，病部是否有白色粉狀物和小黑36 / 66點(diǎn)，挑取小黑點(diǎn)制片(或取制備片 105)，鏡檢閉囊殼的形態(tài)，注意附屬絲的性狀和長(zhǎng)短，然后用解剖針輕壓蓋片，擠壓閉囊殼使之慢慢破裂，注意觀察其內(nèi)子囊的數(shù)目及形態(tài)，能否看到子囊孢子?！　?4)叉絲殼屬(Microsphaera)　　取核桃白粉病()和丁香白粉病()標(biāo)本，觀察癥狀特點(diǎn)?！　?7)鉤絲殼屬 (Uncinula)37 / 66　　取榆樹白粉病()和葡萄白粉病()標(biāo)本觀察癥狀特點(diǎn)，并制片鏡檢38 / 66閉囊殼及附屬絲，注意閉囊殼內(nèi)子囊多數(shù)，附屬絲頂端卷曲呈鉤狀或螺旋狀。球殼目真菌大多是腐生的，其中也有不少是寄生的，以下各屬46 / 66都可引起重要的