【正文】 ) ? 是利用樣品中個組分在色譜柱中的 氣相和固定相 間的 分配系數(shù)不同 達(dá)到分離的目的。 但在親和層析中 ， 配體是通過 共價鍵先與基質(zhì)結(jié)合 ， 配體可以是酶結(jié)合的一個反應(yīng)物或產(chǎn)物 ， 或是一種可以識別靶蛋白的抗體 。 ? 排阻極限 代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到有效分離。 G類Sephadex的型號表示 每克干凝膠吸水量 ， 如 G50表示每克干凝膠吸水量為 5ml。 孔徑大小非常有限 ， 所以可被純化的物質(zhì)的 分子量范圍受到限制 。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。 層析 (chromatography)技術(shù) 層析的主要設(shè)備 常見色譜柱 自動分步收集器 ? 將作為固相成分的不溶性基質(zhì)，例如葡聚糖凝膠、纖維素、樹脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。 有機(jī)溶劑分級分離 ? 丙酮 、 甲醇 、 乙醇等沉淀 : 能使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度將低 。蛋白質(zhì)分離純化 2022328 蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì) ? 蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基 側(cè)鏈中某些基團(tuán) ，在一定 pH的溶液中都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。 低溫 （ 零下 4060度 ） 進(jìn)行 ， 丙酮用量一般 10倍于蛋白質(zhì)溶液體積 。 ? 然后加樣品，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摗? ?分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以 大分子物質(zhì)遷移速度快 ； ?小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部，所以 小分子物質(zhì)遷移速度慢 。 對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用 ，如芳香族化合物與脂蛋白等 。 Sephadex的 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 ，不溶于水、鹽、弱酸和堿， 耐熱耐堿不耐酸。 例如 Sephadex G50的排阻極限為 30,000，它表示分子量大于 30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。 親和層析 (Affinity chromatography) 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過裝有連接了配體的基質(zhì)的親和層析柱時 ， 只有 靶蛋白可以特異地與基質(zhì)結(jié)合 ， 而其它 沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來 。 ? 當(dāng) 汽化后的樣品 被 載氣 帶入色譜柱中運行時，組分就在其中的兩相間進(jìn)行 反復(fù)多次的分配（吸附－脫附－放出） 由于固定相對各種組分的 吸附能力 不同，各組份在色譜柱中的 運行速度 就不同，經(jīng)過一定的柱長后，便彼此分離，按順序離開色譜柱進(jìn)入檢測器，產(chǎn)生的離子流信號經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。因此可用于痕量分析。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進(jìn)了氣相層析的理論，利用 高壓輸送流動相，擁有高效固定相及高靈敏度檢測器， 具有氣相層析的全部優(yōu)點。 離子交換色譜法分離機(jī)理 ? 以凝膠 (gel) 為固定相。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為電泳 (electrophoresis) 。 ? 蛋白質(zhì) b： 由相對分子質(zhì)量為 25000的單一亞基組成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點也是 pI=。 沒通電時的變化 引入電場時的變化 載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移 ， 等電點最低的分子 （ 負(fù)電荷最多的 ）將最快地向陽極遷移 。在生產(chǎn)加工方面， 不同批次之間產(chǎn)品有很大變化，影響分離的重復(fù)性 。 雙向凝膠電泳 ? 雙向凝膠電泳是一種由 任意兩個單向凝膠電泳 組合而成的，即在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進(jìn)行第二向電泳。 常用的軟件如安瑪西亞公司的 Image Master 2D Elite或 Image Master 2D Planium分析軟件。沉降系數(shù)的單位用 Svedberg表示，單位為 秒 ， 1 Svedberg＝ 1013秒 ， 簡稱 S。 主要用于分離細(xì)胞器和病毒。 蔗糖密度梯度離心 等密度離心法 ? 某些密度梯度介質(zhì)經(jīng)過離心后會自身形成梯度，如細(xì)胞分離液 Percoll。 蛋白質(zhì)分子量的測定 最小分子量測定法： 如 Mb含 Fe為 %，則 M=。 雙縮脲反應(yīng) ? 原理： 在堿性溶液中，蛋白質(zhì)因含有兩個以上的肽鍵， 可 與 Cu2+形成 紫紅色絡(luò)合物 ， 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比 ，因此可利用 比色測定 蛋白質(zhì)含量。利用一定波長下， 蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系 ，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。 ? （ 3）干擾物質(zhì)少。 ? （ 2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有： 去污劑、 Triton X100、十二烷基硫酸鈉（ SDS）和 N的 NaOH?？捡R斯亮蘭 G250染料，在 酸性溶液 中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料最大吸收峰的位置由 465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由 棕黑色變?yōu)樘m色 。 Folin酚反應(yīng) ? Folin酚試劑法包括 兩步反應(yīng) ： 第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì) 中的 肽鍵與銅 作用生成 蛋白質(zhì) 銅絡(luò)合物 ；第二步是此絡(luò)合物將 磷鉬酸 磷鎢酸試劑（ Folin 試劑）還原，產(chǎn)生深藍(lán)色 （磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物）， 顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，比色法確定蛋白質(zhì)含量。其實，真實分子量是最小分子量的 n倍， n指 Fe的數(shù)目， Mb的 n=1，所以M=16700； 而 Hb用其他方法測得分子量為 68000，則說 Hb含 4個Fe原子。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于顆粒的密度時，顆粒上??；當(dāng)管頂介質(zhì)的密度小于顆粒的密度時，則顆粒沉降； 最后顆粒進(jìn)入到一個它本身的密度位置，顆粒不再移動，形成穩(wěn)定的區(qū)帶。密度梯度離心法包括 速度區(qū)帶 和 等密度離心 二種方法。 相對離心力 ? 相對離心力 (RCF)是 指在離心力場中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù) 。離心機(jī)的種類繁多，用途各異。這兩項技術(shù)結(jié)合形成的二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。過酸過堿的蛋白質(zhì)較難分離。 其次一些低 pI的載體兩性電解質(zhì)分子 （ 負(fù)電荷比較多的 ） 也將向陽極移動 ， 直到它的凈電荷被減少到零才停止 。 等電聚焦電泳（ isoelectric focusing electrophoresis, IEFE） 利用具有 pH梯度 的支持介質(zhì)分離 等點電不同 的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。 SDS （十二烷基磺酸鈉） ? SDS（十二烷基磺酸鈉） 是一種 陰離子型表面活性劑 ，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約 1 ? 。 ? 小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。 各組分的出峰順序 極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。某些快速分析中，一秒鐘可以分析若干份。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。 所以有時只用親和層析就可使蛋白質(zhì)的純化提高 1000至10000倍 。 ? 肌紅蛋白（馬心肌） 16900 ? 過氧化氫酶（馬肝） 247500 ? 細(xì)胞色素 c（牛心?。? 13370 ?