外源基因的表達(dá)ppt課件(完整版)
【正文】 94等 短小芽孢桿菌的復(fù)制子： 如 pHY481和 pWT481等 含金色葡萄球菌復(fù)制子的質(zhì)粒表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)高，但不穩(wěn)定 ，原因是質(zhì)粒載體與宿主染色體 DNA之間發(fā)生遺傳重組。 以分泌型蛋白的形式表達(dá)外源基因的 優(yōu)點： 在大腸桿菌中高效表達(dá)目的基因的策略 ?高效表達(dá)外源基因須考慮的基本原則： ?優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計。 外源蛋白以分泌型蛋白表達(dá)時，須在 N端加入15～ 30個氨基酸組成的 信號肽（ signal peptides）序列。該方式特別適合表達(dá)外源 小分子 蛋白或多肽。 *融合蛋白與單獨表達(dá)的外源蛋白相比具有以下優(yōu)點： ① 穩(wěn)定性好； ②表達(dá)效率高； ③較易于分離純化。 ① 包涵體蛋白 包涵體 ：在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地集中在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體。 如果外源目的基因 mRNA的主密碼子和受體細(xì)胞基因組的主密碼子相同或接近，則該基因的表達(dá)效率就高； 反之，若外源基因含有較多的罕用密碼子，其表達(dá)水平就低。 ② 翻譯起始密碼子 起始密碼子是翻譯的起始位點，通常為AUG（ ATG） ，編碼甲硫氨酸（ MET）， 是首選的起始密碼子 。 ③ 轉(zhuǎn)錄終止子 轉(zhuǎn)錄終止子 （ terminator）：是一段終止 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的 DNA序列。 啟動子位于基因的上游，其序列的長度因生物的種類而異。表達(dá)載體上的抗藥性基因賦予宿主特定的抗藥性，使其能在抗生素的培養(yǎng)條件下正常生長。 大腸桿菌基因表達(dá)載體可分為 3個系統(tǒng)： DNA復(fù)制及 重組載體的 選擇 系統(tǒng)（復(fù)制子、選擇標(biāo)記） 外源目的基因的 轉(zhuǎn)錄 系統(tǒng) 蛋白質(zhì)的 翻譯 系統(tǒng) 大腸桿菌基因表達(dá)載體 （ 1） DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng) ① 復(fù)制子 復(fù)制子 ：是一段包含復(fù)制起始位點（ ori）和反式因子作用區(qū)在內(nèi)的 DNA片段。 基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。 ?當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基因與 RNA聚合酶作用時，結(jié)構(gòu)基因則開始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的 mRNA。 基因表達(dá) —— 是指 結(jié)構(gòu)基因 在調(diào)控序列的作用下轉(zhuǎn)錄成 mRNA，經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的基因產(chǎn)物 —— 蛋白質(zhì) ，再在受體細(xì)胞環(huán)境中經(jīng) 修飾 而顯示出相應(yīng)的功能。 外源基因表達(dá)系統(tǒng) 基因表達(dá)載體 受體細(xì)胞 基因表達(dá)系統(tǒng) 原核 生物基因表達(dá)系統(tǒng)： 如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。 一、大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌 —— 是一種 革蘭氏陰性細(xì)菌 ，其遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)的水平高，培養(yǎng)周期短。 微生物表型選擇標(biāo)記 顯性標(biāo)記 營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 在基因克隆中絕大多數(shù)的質(zhì)粒載體都是使用 抗菌素抗性記號 ，并且主要集中在 氨芐青霉素抗性 、 四環(huán)素抗性 、 鏈霉素抗性 、 氯霉素抗性 以及 卡那霉素抗性 等少數(shù)幾種抗菌素抗性記號上。 ① 啟動子 啟動子（ promotor）： 是一段能被 宿主 RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合并指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的 DNA序列，是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可使抑制物失活，啟動子功能重新恢復(fù)。 SD序列與核糖體 16S rRNA特異配對而與宿主核糖體結(jié)合，它對 mRNA的翻譯起著決定性的作用。具報道，在大腸桿菌中以四個核苷酸組成的順式序列 UAAU作為 終止密碼 ，可有效地終止多肽鏈的合成。 PL和 PR表達(dá)系統(tǒng) ：是以 λ噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子 PL和 PR構(gòu)建的。 以包涵體形式表達(dá)的外源蛋白最突出的優(yōu)點是： 易于分離純化。 多順反子重組： 多拷貝外源基因有各自的 SD序列、翻譯起始和終止信號，但轉(zhuǎn)錄是在 共同的轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子控制下進(jìn)行的，表達(dá)的外源蛋白分子是相互獨立的。 ?當(dāng)外源基因被交換到染色體上后，由于宿主菌的不斷分裂和增殖，細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒逐漸被稀釋直至消失。 缺點： 外源蛋白分泌型表達(dá)通常產(chǎn)量不高，有時信號肽不被切割或在不適當(dāng)?shù)奈恢冒l(fā)生切割。 二、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 芽孢桿菌 —— 屬 革蘭氏陽性菌 ，細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，能將表達(dá)蛋白分泌到細(xì)胞外。 整合質(zhì)粒： 在大腸桿菌質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建而成，不含在芽孢桿菌進(jìn)行復(fù)制的起始序列，因而不能在芽孢桿菌中自主復(fù)制，但它能 插入到宿主染色體 并將外源基因和標(biāo)記基因整合到染色體上，隨細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制，該方式表達(dá)外源基因解決了芽孢桿菌中質(zhì)粒不能穩(wěn)定遺傳的問題。 ?編碼蛋白質(zhì)的堿基序列中 GC的平均含量高達(dá) 73％，密碼子的第一、第二和第三位堿基的 GC含量分別達(dá) 66％、 53％和 93％，而該現(xiàn)象不存在于非編碼區(qū)。 ?細(xì)胞壁屬 G－ ，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化。 ?外源基因融合表達(dá)。 ?多種藍(lán)藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。 ?密碼子的 第三位堿基 具有明顯的選擇性，一般 C的頻率明顯高于 G的頻率 。 宿主菌 常用的宿主菌 枯草芽孢桿菌 短小芽孢桿菌 地衣芽孢桿菌
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