【正文】 往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對之進行改造構(gòu)建： （ 1） 加入合適的選擇標記基因 ，如兩個以上，易于用作選擇 （ 2） 增加或減少合適的酶切位點 ，便于重組 （ 3） 縮短長度 ，切去不必要的片段，提高導入效率， 增加裝載量 （ 4） 改變復制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝 （ 5）根據(jù)基因工程的特殊要求 加裝特殊的基因元件 方法就是重組，拼拼接接，挖肉補瘡。 pYAC載體具有以下特點： 1） 雙 TEL位點； 2） 三個酵母菌遺傳標記基因； 3） 一個 SUP4基因用于檢測重組子 ，其原理是： SUP4是 tRNAtyr的赭色抑制突變基因，但把該基因轉(zhuǎn)入酵母菌的 ade2赭色突變體時，宿主菌為白色菌落，要是在 SUP4基因中插入外源 DNA片段后在轉(zhuǎn)化 ade2宿主菌，轉(zhuǎn)化子成紅色菌落。 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第二節(jié) λ噬菌體載體 二、 l噬菌體載體的構(gòu)建 3. 構(gòu)建 琥珀型密碼子突變體 ? 終止密碼子有三種： UAA（赭石）； UGA（乳白）； UAG（琥珀） ? 琥珀型突變： CAGUAG（ stop） ? 將野生型 λ DNA上 A和 B兩個頭部包裝蛋白的基因中的 CAG密碼子突變成 UAG，當這種 lDNA進入一般大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的 A和 B頭部蛋白，也就 不能被包裝，不能裂解細菌 。 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第三節(jié) Cosmid載體 三、 Cosmid的優(yōu)越性 1. 能象 lDNA一樣體外包裝，并高效導入受體細胞 2. 可以裝載比質(zhì)?；?lDNA大得多的外源 DNA片段，如 cos區(qū)及附近順序長為 kb，質(zhì)粒長為 ，則該 Cosmid最大可裝載 DNA 3. 由于攜帶質(zhì)粒的選擇標記，便于篩選 4. 由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。 ? 可以定向地克隆 DNA片段 ， 克隆在 M13 RF DNA分子上的雙鏈 DNA片段 ， 到了子代噬菌體便成了單鏈的形式 。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。 2. 組成 ： pMB1和病毒復制起點（如 SV40， BPV， EBV等），適合于細菌和動物細胞的選擇標記基因。其中 T抗原參與 SV40的有效感染，并能特異地結(jié)合在病毒 DNA復制起點上，這種結(jié)合對 DNA復制是必須的。 動物分子克隆載體 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 （二） 病毒型載體 1. 特點 1) 可在動物細胞中形成病毒顆粒（形態(tài)構(gòu)成組分來自天然病毒或原病毒細胞） 2) DNA轉(zhuǎn)移效率高，但必須與天然 (輔助 )病毒共感染動物細胞 3) 大多數(shù)被感染動物細胞將是致死的，但有少數(shù)病毒（如逆病毒）載體可穩(wěn)定整合到染色體 DNA中。 根據(jù) M13的生物學特性知道 ， M13子代噬菌體中總是只含有 （ ＋ ） 鏈 ， 所以 M13載體克隆的外源 DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有 DNA分子中的哪條鏈 ， 則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時的取向 。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接； ②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結(jié)果的分析，后來專門選出 30～ 45kb的外源 DNA插入載體 DNA，此時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度； ③細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費時間。 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第二節(jié) λ噬菌體載體 三、 lDNA作為載體的優(yōu)點 1. lDNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌 2. lDNA作為載體，其裝載外源 DNA的能力為 25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量 3. 重組 lDNA的篩選較為方便 4. 4. 重組 lDNA分子的提取比質(zhì)粒容易 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第三節(jié) Cosmid載體 一、 Cosmid的定義 ? Cosmid（ cos site— carrying plasmid） ： 是一類由人工構(gòu)建的含有 lDNA兩端 cos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型的質(zhì)粒載體 。 左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負責裂解宿主細胞， DNA自主復制以及調(diào)控基因，中間是負責與宿主染色體 DNA遺傳重組整合的基因 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 第二節(jié) λ噬菌體載體 二、 l噬菌體載體的構(gòu)建 ? 天然的 l－ DNA由于包裝上下限的存在以及同種酶切口太多不適合作為重組實驗的載體 ? 1. 縮短長度 野生型 l－ DNA包裝的上限為，本身長度為 ，那么外源 DNA片段允許插入的大小至多為 ，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，如果將縮短便提高裝載量。 2. 測序質(zhì)粒 拷貝數(shù)高，加裝測定順序所必需的序列，如多切口接頭，便于各種片段方便克隆 3. 整合質(zhì)粒 裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因準確重組整合入受體細胞的染色體上 4. 穿梭質(zhì)粒 含有兩個不同的復制子，能在兩種不同的受體細胞中復制 5. 表達質(zhì)粒 裝有強的啟動基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細胞內(nèi)的高效表達 6. 探針質(zhì)粒 篩選克隆或?qū)ふ一蛟?，他通常裝有一個可以定量測定其表達的標記基因，如抗性基因。在不同條件下，它可以質(zhì)粒或噬菌體的復制起點進行復制，從而獲得質(zhì)粒 ds DNA或噬菌體 ss –DNA 又如：釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）的某些載體既含有質(zhì)粒（ 2μ ）復制起點，又含有 ARS片段 b. 不同生物復制起點混合 —穿梭載體 （ shuttle vector） 兩種生物中均以質(zhì)粒形式存在；在一種生物中以質(zhì)粒形式存在，在另一種生物中以質(zhì)粒或病毒形式存在 * 穿梭載體范圍 ：細菌 —細菌（放線菌），細菌 —酵母菌， 細菌 —真菌，細菌 —動物 2021/11/10 蘇州科技學院生物系 葉亞新 分子克隆載體的復制起點種類、標記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系 1. 復制起點種類與拷貝數(shù)間的關(guān)系 1) 質(zhì)粒復制起點類型：低拷貝（嚴緊型， 12 copies，受宿主染色體基因控制）；高拷貝（松弛型， 20 copies，受宿主染色體控