【正文】 不導(dǎo)致動物細(xì)胞死亡。由于動物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而 病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。許多 M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體 pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選擇上更為方便。進(jìn)入細(xì)胞后，通過質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第二節(jié) λ噬菌體載體 二、 l噬菌體載體的構(gòu)建 2. 刪除重復(fù)的酶切口 ? 插入型載體在插入位點(diǎn)有一酶切口，但這必須是唯一的； ? 取代型載體在取代位點(diǎn)有兩個(gè)酶切口，多了也不行 ? 天然的 lDNA上有許多重復(fù)的酶切口，如： EcoRI 5個(gè)， HindIII 7個(gè)，這些多余的酶切口必須被刪除。 三、其他質(zhì)粒載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 二、 釀酒酵母 (Saccharomycea cerevisiae)的分子克隆載體 1) 按復(fù)制方式劃分 i. 自主復(fù)制型； ii. 整合型（非自主復(fù)制型） Yeast Integration plasmid(YIp) 2)按復(fù)制子來源劃分 i. 附加體型 yeast episomal plasmid(YEp)，其復(fù)制起點(diǎn)來自于釀酒酵母的天然質(zhì)粒 2μ質(zhì)粒 ii. 染色體復(fù)制型 Yeast Replicating plasmid(YRp)，其復(fù)制起點(diǎn)來自染色體上的自主復(fù)制序列 (ARSautonomous replicating sequence) 三、其他質(zhì)粒載體 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 4. pYAC載體 酵母菌人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)廣泛用于構(gòu)建高等動植物基因組文庫的構(gòu)建 , 由 YLp經(jīng)適當(dāng)改造后構(gòu)建成 pYAC載體。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 特征 ? 攜帶遺傳標(biāo)記 ? 在實(shí)驗(yàn)室中將質(zhì)粒通過物理方法導(dǎo)入受體細(xì)胞，但是即使在最佳條件下，受體細(xì)胞中也只有少數(shù)細(xì)胞能穩(wěn)定地接受質(zhì)粒，要想找到這些進(jìn)入了質(zhì)粒的受體細(xì)胞，就要利用載體質(zhì)粒上的遺傳標(biāo)記，天然質(zhì)粒上碰巧攜帶許多功能基因，它們便可被用作選擇標(biāo)記。 8） 發(fā)光蛋白質(zhì)基因 發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具 β —半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為 α 互補(bǔ)作用 。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 2) 氨芐青霉素抗性基因 （ Apr） Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三章 基因工程的載體 ? 作為基因工程載體的 基本功能 1. 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 2. 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 3. 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第三章 基因工程的載體 ? 作為基因工程載體必須具備的 基本條件 1. 具有對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 2. 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) 3. 長度盡可能小，以提高其載裝能力 4. 具有多種單一的酶切位點(diǎn) 5. 具有合適的選擇性標(biāo)記 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 遺傳標(biāo)記基因 1. 標(biāo)記基因的作用 1）指示外源 DNA分子（載體或重組分子） 是否進(jìn)入宿主細(xì)胞 這種指示可以是選擇性的（ Apr ， Tcr ， Kanr），也可以是非選擇性的（如 lacZ） 2） 指示外源 DNA分子 是否插入載體分子 形成了重組子。 * 這種指示也可以是 選擇性 的（如 TcS），也可以是 非選擇性 的（如 TcS， lacZα, GUS ），絕大多數(shù)為后者。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化 β —內(nèi)酰胺環(huán)的 水解 ，使氨芐青霉素失活。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在， 分別由兩個(gè)基因編碼。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)與種類 1. 復(fù)制起點(diǎn)的種類 1) 核內(nèi)復(fù)制起點(diǎn) a. 染色體復(fù)制起點(diǎn) —原核生物 (環(huán)狀 )和真核生物 (線狀 )染色體 b. 染色體外復(fù)制起點(diǎn) i. 質(zhì)粒 —DNA,RNA,線狀 ,環(huán)狀 ,單鏈 ,雙鏈 ii. 病毒 —同上 , 細(xì)胞內(nèi)和病毒顆粒內(nèi) 2) 核外復(fù)制起點(diǎn) a. 線粒體 —所有真核細(xì)胞 b. 葉綠體 —所有綠色植物細(xì)胞 原核與真核生物 兩種質(zhì)體中亦可能含有質(zhì)粒 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 3. 按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體 1) 質(zhì)粒復(fù)制型 —復(fù)制起點(diǎn)來自質(zhì)粒或線粒體和葉綠體 2) ARS復(fù)制型 —ARS（ autonomus replicative sequence)，或稱染色體復(fù)制型 3) 病毒復(fù)制型 —復(fù)制起點(diǎn)來自病毒，若為 RNA病毒，必須反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 一、質(zhì)粒（ plasmid）的一般性質(zhì) 分類 接合型 和非接合型 嚴(yán)緊性和 松弛型 在基因工程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 理想質(zhì)粒載體所具備的條件 ? 質(zhì)粒較小 ? 質(zhì)粒帶有可供選擇的標(biāo)記 ? 帶有盡可能多的單一限制酶切位點(diǎn) ? 應(yīng)有較高的基因表達(dá)能力 2021/11/10 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 二、質(zhì)粒（ plasmid）載體的構(gòu)建 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 ? 天然質(zhì)粒往