【正文】 mL、 mL、 mL、 mL 的牛奶，然后向 2~5 號樣品中添加不同體積的尿素溶液，使得總體積都為 1 mL，配制的樣品編號及含量如表 21 所示。 圖 21 722 型光柵分光光度計 實驗藥品：酒石酸鉀鈉、碘化鉀、 酪蛋白（用作標準蛋白）、 乙腈、 6%NaOH溶液。再吸取 10 mL 定容后的樣品液，沿小玻璃杯移入反應(yīng)室，并用少量的蒸餾水沖洗小玻璃杯，塞緊棒狀杯塞。 1) 試樣消化。 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 10 第 2章 實驗材料及方法 用凱氏定氮法測定牛奶中的蛋白質(zhì)含量 實驗儀器及藥品 實驗儀器：凱氏定氮裝置、凱氏燒瓶、冷凝管、接收瓶、燒杯、移液管、100 mL 容量瓶 、 量筒 、 酸式滴定管 、 分析天平、電熱套、研缽 、 藥匙、玻璃棒、膠頭滴管、吸管、燒杯和試管若干、鐵架臺等。 本研究的目的是從幾種傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測定方法中來尋找適合乳品蛋白質(zhì)測定的方法。而反向色譜法則一般用非極性固定相（如 C1 C8)；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。 ⑤ 應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、 熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。除上述優(yōu)點之外， Bradford 法干擾物質(zhì)少，如干擾福林 酚試劑法的 K+、 Na+、 Mg2+ 離子、 Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、 EDAT 等物質(zhì)均不會對 Bradford 法造成干擾 [22]。超過穩(wěn)定時間 之后 ,蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物就會發(fā)生聚合并沉淀出來。 需要注意的是，在進行測定時 ,加入福林 酚試劑時要特別小心 ,因為該燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 6 試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定 ,但上述的還原反應(yīng)只能在 pH=10的 情況下才可以進行 ,故當福林 酚試劑加入堿性的銅 蛋白質(zhì)溶液中時 ,必須立即混勻 ,以便在磷鋁酸 磷鎢酸試劑在遭到破壞之前 ,還原反應(yīng)就能發(fā)生 [15]。 Lowry 法是最靈敏的蛋白質(zhì)測定方法之一 ,該法在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用 。而且使用的試劑價廉易得，操作簡便，可測定的范圍為 1～ 10 mg 蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含量的測定，能測出的蛋白質(zhì)含量須在約 mg 以上。 雙縮脲法 (Biuret 法 ) 雙縮脲 (H2NOC－ NH－ CONH2)是兩個分子脲在 180 ℃ 左右加熱，放出一分子氨后得到的產(chǎn)物。消化之后向消化液中加入濃堿，濃堿可以使消化液中的硫酸銨分解 ,游離出氨 ,水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量 一定濃度的硼酸溶液中 ,該過程被稱為“堿化蒸餾”。因此，近年來，人們發(fā)展了許多測定蛋白質(zhì)的方法。 過去幾十年中，乳品經(jīng)常被用作為嬰幼兒和老弱病 殘孕的營養(yǎng)食品，到近些年，乳品已就成為多數(shù)人的生活必需品，因此，牛乳的產(chǎn)銷量在持續(xù)不斷的快速增長，同時，乳制品消費量的急劇增大也導(dǎo)致了奶源的嚴重不足。 關(guān)鍵詞 牛奶蛋白質(zhì)；凱氏定氮法；雙縮脲法；考馬斯亮藍法；反相高效液相色譜法；有機溶劑沉淀法 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） II Abstract In this paper, the Kjeldahl method, biuret method, Coomassie brilliant blue method and high performance liquid chromatography(HPLC), respectively, for milk and milk mixed with urea and melamine test samples analyzed and measured by several methods for parison. In the biuret method and Coomassie brilliant blue method for sample pretreatment of choice is an anic solvent precipitation method using acetonitrile extract the protein in milk. HPLC with reversedphase chromatography using ZORBAX300SBC18 column (250 mm mm, 5 μm) and a UV detector, using standard addition method for pure milk sample content of urea and melamine the detection and analysis. Through analysis and parison of results shows that, with the Kjeldahl nitrogen content measured by the total nitrogen content of the milk, the method consumes a long time and plicated operation. With the biuret method and Coomassie blue staining than Kjeldahl method is simple and rapid, and these two methods can also be quickly and accurately detect the protein content. By reversedphase highperformance liquid chromatography peaks when the sample in place will not be interference from other ponents in milk, it can be used in dairy products of urea and melamine accurate detection and analysis. Keywords Kjeldahl method。 分析比較幾種方法，并提出自己的看法。 參 考 資 料 中國期刊數(shù)據(jù)庫 蛋白質(zhì)的檢測方法與乳制品中蛋白含量測定 奶制品中蛋白質(zhì)測定方法相關(guān)文獻 周 次 第 1 ～ 4 周 第 5～ 10 周 第 11～ 13周 第 14～ 16 周 第 17～ 20 周 應(yīng) 完 成 的 內(nèi) 容 查 閱 相 關(guān)文獻，了解 奶制品中氮含量的測定方法，提交文獻綜述。 通過對結(jié)果的分析以及對比可知，用凱氏定氮法測得的氮含量是牛奶中的總氮含量，該方法消耗時間長，操作繁瑣。蛋白質(zhì)作為人類最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一 , 是生物體細胞的重要組成成分，有許多的生物學(xué)功能。例如 20xx 年的三鹿奶粉事件所造成的后果和社會影響說明，乳品質(zhì)量好壞與否不僅關(guān)系到嬰幼兒和青少年的健康成長，也關(guān)系到無數(shù)家庭的幸福、社會的和諧以及我們國家 的形象。其中，凱氏定氮法是國家標準和國際標準中首推的蛋白質(zhì)的檢測方法。所以該方法一般是在實驗室通風性較好的條件下由訓(xùn)練有素的人員來完成 [11]。 具有兩個酰胺基或兩個直接相連的肽鍵，或間隔一個碳原子相連的肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物，他們也都可以發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。若樣品酸度較高 ,顯色后會較淺 ,則必須提高碳酸鈉 氫氧化鈉溶液的濃度 12 倍 。其缺點有：消耗時間較長 ,而且要精確的控制操作的時間 ,標準曲線也不是嚴格的直線形式 ,且專一性較差 ,干擾物質(zhì)較多。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) (101000 μg/mL)， 蛋白質(zhì)和染料結(jié)合的規(guī)律符合比爾定律 (Beer’s Law)[17]。 Bradford 法測 定蛋白質(zhì)含量的另一個優(yōu)點在于它測定的快速和簡便性。除此之外，在測定中 , 也會有少部分的蛋白 染料復(fù)合物吸附于比色皿的壁上 ,實驗證明這種蛋白 染料復(fù)合物的吸附的影響是可以忽略的 ,實驗完畢后用乙醇可以將藍色的比色皿清洗干凈。 ③ 高效：分離效能高。 高效液相色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法。然而在牛奶中摻入廉價的水解蛋白、其他動物乳或者含氮有機化合物等新的摻假方式，傳統(tǒng)的檢測方法 [2934]則難以檢出，現(xiàn)在的乳品檢測技術(shù)往往是等參假物出來后才能確定相對的檢測技術(shù)，因而不能未卜先知。 （ 2） 使用雙縮脲 (Lowry)法、 Bradford方法檢測牛奶中的蛋白質(zhì)的含量，并與國標法結(jié)果進行比較。 4) 混合催化劑 ： 五水硫酸銅和硫酸鉀分別研碎 ,按 1:15 的比例混合均勻。 2) 堿化蒸餾。 4) 計算。 6%NaOH 溶液：先配成 NaOH 濃溶液，然后稀釋成 6%NaOH 溶液。 實驗操作步驟 1）標準蛋白曲線的繪制 (1)取 6 支試管，編號，取出一支試管作為空白對照，然后 分別向其余的 5 支試管中準確的 加入 0mL， mL， mL， mL， mL， mL濃度為 lmg/mL 標準蛋白質(zhì)溶液 ， 然后用蒸餾水分別將各試管補齊到 mL（如表 23 所示）。 實驗操作及步驟 試劑的準備 考馬斯亮藍 G250 溶液：稱取 100mg 考馬斯亮藍 G250，溶于 50 mL乙醇中，加入 100 mL 85%的磷酸，再用蒸餾水定容到 1 L，濾紙過濾。 實驗操作步驟 1）標準蛋白曲線的繪制 (1)取 6 支試管，編號，取出一支試管作為空白對照， 然后分別向其余的 5 支試管中準確的加入 0 mL， mL， mL， mL， mL， mL濃度為 l mg/mL 標準蛋白質(zhì)溶液 ， 然后用蒸餾水分別將各試管補齊到 mL， 其添加方法 及順序如表 26 所示。 注：在本方法中所用的水均為超純水。稱取 g 磷酸二氫鉀（準確至 g），加 800 mL 水使其完全溶解后，再用磷酸調(diào)節(jié)為 pH=，用水稀釋至 1L，用 181。 取已知三聚氰胺或尿素含量的牛奶樣品，對應(yīng)的加入一定量的標準儲備液，按 “ 樣品前處理 ” 操作，平行制備 3 份，得到樣品溶液后按上述色譜條件對應(yīng)的進行進樣分析。 標準蛋白曲線的繪制 依照 中表 23 的方法用 722 型光柵分光光度計測各濃度標準酪蛋白溶液在 550nm處的吸光度值 A550nm，測得的數(shù)值如表 33 所示。由此看來，使用雙縮脲法測定摻入尿素的牛奶樣品的方法基本準確，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性第 3章 實驗結(jié)果與分析 25 和重現(xiàn)性一般，因此需要通過多次重復(fù)實驗得到多組數(shù) 據(jù)求平均值才可以得到比較準確的結(jié)果。根據(jù) 中得到的牛奶中的蛋白質(zhì)的濃度為 g/100mL，可以計算出 中 2 中牛奶樣品摻雜所需要的尿素溶液的濃度為 g/100mL，所需三聚氰胺溶液的濃度為 g/100mL。 表 39 考馬斯亮藍法測得的添加尿素溶液的樣品在 595nm 處的吸光度值 A595nm 試管編號 1 2 3 4 5 吸光度值 A595nm 結(jié)果分析 從表 35可以看出牛奶中摻入不同比例尿素溶液用考馬斯亮藍法檢測摻假的牛奶 中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、 %,其對應(yīng)的標準偏差分別為 %、 %、 %、 %。 反向高效液相色譜法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 尿素標準曲線和三聚氰胺標準曲線的繪制 尿素標準曲線 使用高效液相色譜儀，按照 中 3 中 1）的色譜條件對 中 1 中1）所處理好的不同濃度的尿素標準溶液進行進樣檢測，測得的峰面積如表313 所示。 第 3章 實驗結(jié)果與分析 29 表 310 考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號 實測值 / g/L 平均值 / g/L 理論值 / g/L 誤差率/ % RSD/% 1 2 3 4 5 考馬斯亮藍法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 實驗數(shù)據(jù)及處理 同理可得 用 722 型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在 595nm 處的吸光度值 A595nm，測得的數(shù)值如表 311所示。 第 3章 實驗結(jié)果與分析 27 表 38 考馬斯亮藍法測得的標準酪蛋白溶液在 595nm 處的吸光度值 A595nm 蛋白質(zhì)含量/ 100μg/mL 0 吸光度值A(chǔ)595nm 0 0 0 其對應(yīng)蛋白質(zhì)含量的吸光度的平均值分別為： 0、 、 、 、 。 表 36 雙縮脲法測得的添加三聚氰胺溶液的樣品在 550nm 處的吸光度值 A550nm 試管編號 1 6 7 8 9 吸光度值A(chǔ)550nm