【正文】 反應(yīng)即雙縮脲反應(yīng)。 具有兩個酰胺基或兩個直接相連的肽鍵，或間隔一個碳原子相連的肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物，他們也都可以發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。雙縮脲法的缺點是精確度低、所需樣品量大，干擾此測定的物質(zhì)有很多。若樣品酸度較高 ,顯色后會較淺 ,則必須提高碳酸鈉 氫氧化鈉溶液的濃度 12 倍 。 （ 1） 實驗原理 福林 酚試劑法的顯色原理是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上 [12],加入了第二種試劑 —— 福林 酚試劑 ,增加了顯色量 ,從而達(dá)到了提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度的效果。其缺點有：消耗時間較長 ,而且要精確的控制操作的時間 ,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式 ,且專一性較差 ,干擾物質(zhì)較多。 考馬斯亮藍(lán)法（ Bradford 法） 由于 Biuret 法和 Lowry 法存在著很多的弊端，因此人們開始去尋找更加完善的蛋白質(zhì)測定方法。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) (101000 μg/mL)， 蛋白質(zhì)和染料結(jié)合的規(guī)律符合比爾定律 (Beer’s Law)[17]。蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù) ,因此在測定蛋白質(zhì)時的靈敏度很高 [18,19]。 Bradford 法測 定蛋白質(zhì)含量的另一個優(yōu)點在于它測定的快速和簡便性。 Bradford 法在測定蛋白質(zhì)含量時也有一些不足之處。除此之外，在測定中 , 也會有少部分的蛋白 染料復(fù)合物吸附于比色皿的壁上 ,實驗證明這種蛋白 染料復(fù)合物的吸附的影響是可以忽略的 ,實驗完畢后用乙醇可以將藍(lán)色的比色皿清洗干凈。 高效液相色譜法是在經(jīng)典的液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。 ③ 高效：分離效能高。 此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。 高效液相色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。然而在牛奶中摻入廉價的水解蛋白、其他動物乳或者含氮有機化合物等新的摻假方式，傳統(tǒng)的檢測方法 [2934]則難以檢出，現(xiàn)在的乳品檢測技術(shù)往往是等參假物出來后才能確定相對的檢測技術(shù)，因而不能未卜先知。主要選用考馬斯亮藍(lán)法 (Bradford法 ) [29,35]，雙縮脲法 [31]，與凱氏定氮法的結(jié)果進(jìn)行比較，從中找出最適合乳源蛋白質(zhì)測定的方法。 （ 2） 使用雙縮脲 (Lowry)法、 Bradford方法檢測牛奶中的蛋白質(zhì)的含量，并與國標(biāo)法結(jié)果進(jìn)行比較。 實驗藥品：純牛奶、 96%濃硫酸、 40%(m/m)氫氧化鈉溶液、 20 g/L 的硼酸溶液、 、 無水 乙醇、中性甲基紅、亞甲藍(lán)溶液、硫酸鉀、五水硫酸銅、 30%過氧化氫、蒸餾水等。 4) 混合催化劑 ： 五水硫酸銅和硫酸鉀分別研碎 ,按 1:15 的比例混合均勻。 精密稱取牛奶樣品（空白樣為加蒸餾水） 5 ml,小心放入干燥的凱氏燒瓶中 , 避免試樣附著在管壁；加入混合催化劑 10 g, 與試樣混合均勻； 再加入 25 mL 硫酸和 5 mL 的雙氧水；然后將燒瓶以 45176。 2) 堿化蒸餾。向小玻璃杯中加入 20～ 30 mL40%的氫氧化鈉溶液（過量），慢慢提起棒狀杯塞，使氫氧化鈉緩慢流入反應(yīng)室（防止反應(yīng)室氣體從杯塞處 外泄），立即塞緊棒狀杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸餾水使之密封。 4) 計算。 實驗操作及步驟 試劑的準(zhǔn)備 雙縮脲試劑：稱取沒有丟失結(jié)晶水的硫酸銅（ CuSO4 6%NaOH 溶液：先配成 NaOH 濃溶液，然后稀釋成 6%NaOH 溶液。 表 21 雙縮脲法測定方法中 牛奶中添加尿素溶液的配制 樣品編號 牛奶所占比例 牛奶 / mL 尿素溶液 / mL 1 100% 1 0 2 90% 3 80% 4 70% 5 50% 2）牛奶中摻入三聚氰胺溶液的摻假 樣品處理 根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置三聚氰胺溶液，使每毫升三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量。 實驗操作步驟 1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制 (1)取 6 支試管，編號，取出一支試管作為空白對照，然后 分別向其余的 5 支試管中準(zhǔn)確的 加入 0mL， mL， mL， mL， mL， mL濃度為 lmg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 ， 然后用蒸餾水分別將各試管補齊到 mL（如表 23 所示）。 (3)以用吸光度值 A550nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量 (mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 實驗操作及步驟 試劑的準(zhǔn)備 考馬斯亮藍(lán) G250 溶液：稱取 100mg 考馬斯亮藍(lán) G250，溶于 50 mL乙醇中，加入 100 mL 85%的磷酸，再用蒸餾水定容到 1 L，濾紙過濾。 取不同體積的牛奶 4 份，以樣品 1 作為對照樣，樣品 6~9 分別為 mL、 mL、 mL、 mL 的牛奶，然后向 2~5 號樣品中添加不同體積的三聚氰胺溶液，使得總體積都為 1 mL，配制的樣品編號及含量如表 25 所示。 實驗操作步驟 1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制 (1)取 6 支試管，編號，取出一支試管作為空白對照， 然后分別向其余的 5 支試管中準(zhǔn)確的加入 0 mL， mL， mL， mL， mL， mL濃度為 l mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 ， 然后用蒸餾水分別將各試管補齊到 mL， 其添加方法 及順序如表 26 所示。 表 26 考馬斯亮藍(lán)法實驗表 1 2 3 4 5 6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 /mL 0 蒸餾水 /mL 2）樣品中的蛋白含量測定 取 9 只試管并編號， 1~9 號試管中各按 中 2 中的順序?qū)?yīng)的取一定量的摻雜不同濃度并處理過的未知樣品，按照 1）中的測定方法，使未知樣品測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定范圍內(nèi)。 注：在本方法中所用的水均為超純水。再將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋得到的濃度為 5 μg/mL、 25 μg/mL、 50 μg/mL、 75 μg/mL、 100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。稱取 g 磷酸二氫鉀（準(zhǔn)確至 g），加 800 mL 水使其完全溶解后，再用磷酸調(diào)節(jié)為 pH=，用水稀釋至 1L，用 181。 色譜條件： 色譜柱： ZORBAX300SBC18色譜柱（ 250 mm mm， 5 μm） 檢測器：紫外檢測器 流動相：乙腈：水 =5： 95 (體積比 ) 檢測波長： 220 nm 流速： 1 mL/min 柱溫：室溫 進(jìn)樣體積： 10 μL 在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入尿素標(biāo)準(zhǔn) 系列溶液，記錄色譜峰面積，以尿素溶液的質(zhì)量濃度（ mg/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 取已知三聚氰胺或尿素含量的牛奶樣品，對應(yīng)的加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按 “ 樣品前處理 ” 操作，平行制備 3 份，得到樣品溶液后按上述色譜條件對應(yīng)的進(jìn)行進(jìn)樣分析。因此，凱 氏定氮法適合用于測定樣品的總 的氮含量。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制 依照 中表 23 的方法用 722 型光柵分光光度計測各濃度標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液在 550nm處的吸光度值 A550nm，測得的數(shù)值如表 33 所示。 雙縮脲法對摻雜尿素溶液的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 實驗數(shù)據(jù)及處理 依照 中 2）中的方法用 722 型光柵分光光度計進(jìn)行測各摻入不同比例的尿素溶液的未知樣品溶液在 550nm處的吸光度值 A550nm，測得的數(shù)值如表 34 所示。由此看來，使用雙縮脲法測定摻入尿素的牛奶樣品的方法基本準(zhǔn)確，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性第 3章 實驗結(jié)果與分析 25 和重現(xiàn)性一般，因此需要通過多次重復(fù)實驗得到多組數(shù) 據(jù)求平均值才可以得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果。 結(jié)果分析 從表 37可以看出牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液 用雙縮脲法檢測摻假的牛奶中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、 %， 其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 %、 %、 %、 %。根據(jù) 中得到的牛奶中的蛋白質(zhì)的濃度為 g/100mL，可以計算出 中 2 中牛奶樣品摻雜所需要的尿素溶液的濃度為 g/100mL，所需三聚氰胺溶液的濃度為 g/100mL。 圖 32 考馬斯亮藍(lán)法測得的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖 32 所示，考馬斯亮藍(lán)法以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，由所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，其線性方程為 Y=－ ，相關(guān)系數(shù)為 R2=，這表明酪蛋白與考馬斯亮藍(lán) G250 試劑的線性關(guān)系好，因此可知考馬斯亮藍(lán)法所0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .00 .0 50 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .3 50 .4 0吸光度A595nm蛋 白 質(zhì)含量(100 μ g/mL)Y = 1 5 7 0 7 1R2= 2 3燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 28 需的標(biāo)準(zhǔn)蛋 白可以用酪蛋白。 表 39 考馬斯亮藍(lán)法測得的添加尿素溶液的樣品在 595nm 處的吸光度值 A595nm 試管編號 1 2 3 4 5 吸光度值 A595nm 結(jié)果分析 從表 35可以看出牛奶中摻入不同比例尿素溶液用考馬斯亮藍(lán)法檢測摻假的牛奶 中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、 %,其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 %、 %、 %、 %。 [樣品體積 （ mL） 1000] 表 311 考馬斯亮藍(lán)法測得的添加三聚氰胺的未知樣品在 595nm 處的吸光度值 A595nm 試管編號 1 6 7 8 9 吸光度值 A595nm 計算可得考馬斯亮藍(lán)法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表 312 所示。 反向高效液相色譜法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線和三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線 使用高效液相色譜儀，按照 中 3 中 1）的色譜條件對 中 1 中1）所處理好的不同濃度的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣檢測，測得的峰面積如表313 所示。 由此看來，使用考馬斯亮藍(lán)法測定摻入三聚氰胺的牛奶樣品的方法與理論差值的誤差比較大，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此該方法可以不通過進(jìn)行多次重復(fù)實驗就可以得到結(jié)果。 第 3章 實驗結(jié)果與分析 29 表 310 考馬斯亮藍(lán)法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號 實測值 / g/L 平均值 / g/L 理論值 / g/L 誤差率/ % RSD/% 1 2 3 4 5 考馬斯亮藍(lán)法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 實驗數(shù)據(jù)及處理 同理可得 用 722 型光柵分光光度計進(jìn)行測各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在 595nm 處的吸光度值 A595nm，測得的數(shù)值如表 311所示。 以根據(jù)表 39 中測得的 樣品的吸光度值在圖 32 所示的 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量 (mg)，代入下式： 蛋白質(zhì)含量（ mg/mL） =標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量 （ μg/mL) 500(mL) 247。 第 3章 實驗結(jié)果與分析 27 表 38 考馬斯亮藍(lán)法測得的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液在 595nm 處的吸光度值 A595nm 蛋白質(zhì)含量/ 100μg/mL 0 吸光度值A(chǔ)595nm 0 0 0 其對應(yīng)蛋白質(zhì)含量的吸光度的平均值分別為： 0、 、 、 、 。 考馬斯亮藍(lán)法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算 中 2 中提到需要根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液和三聚氰胺溶液，使每毫升尿素溶液和三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量的方法對樣品進(jìn)行摻雜。 表 36 雙縮脲法測得的添加三聚氰胺溶液的樣品在 550nm 處的吸光度值 A550nm 試管編號 1 6 7 8 9 吸光度值A(chǔ)550nm 表 37 雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號 實測值 / g/L 平均值 / g/L 理論值 / g/L 誤差率/ % RSD/% 1 6 7 8 9 以根據(jù)表 36 中測得的 樣品的吸光度值在圖 31 所示的 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 26 對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量 (mg)，代入下式： 蛋白質(zhì)含量（ mg/mL） =標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量 （ mg/mL) 50(mL)247。 樣品體積（ mL） 計算可得雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表 35 所示。根據(jù)上述 數(shù)據(jù)作 蛋白質(zhì)含量 吸光度圖，得到 雙縮脲法