【正文】 反應(yīng)即雙縮脲反應(yīng)。 具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接相連的肽鍵，或間隔一個(gè)碳原子相連的肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物，他們也都可以發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。雙縮脲法的缺點(diǎn)是精確度低、所需樣品量大，干擾此測(cè)定的物質(zhì)有很多。若樣品酸度較高 ,顯色后會(huì)較淺 ,則必須提高碳酸鈉 氫氧化鈉溶液的濃度 12 倍 。 （ 1） 實(shí)驗(yàn)原理 福林 酚試劑法的顯色原理是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上 [12],加入了第二種試劑 —— 福林 酚試劑 ,增加了顯色量 ,從而達(dá)到了提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度的效果。其缺點(diǎn)有：消耗時(shí)間較長(zhǎng) ,而且要精確的控制操作的時(shí)間 ,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式 ,且專(zhuān)一性較差 ,干擾物質(zhì)較多。 考馬斯亮藍(lán)法（ Bradford 法） 由于 Biuret 法和 Lowry 法存在著很多的弊端，因此人們開(kāi)始去尋找更加完善的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) (101000 μg/mL)， 蛋白質(zhì)和染料結(jié)合的規(guī)律符合比爾定律 (Beer’s Law)[17]。蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù) ,因此在測(cè)定蛋白質(zhì)時(shí)的靈敏度很高 [18,19]。 Bradford 法測(cè) 定蛋白質(zhì)含量的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它測(cè)定的快速和簡(jiǎn)便性。 Bradford 法在測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)也有一些不足之處。除此之外，在測(cè)定中 , 也會(huì)有少部分的蛋白 染料復(fù)合物吸附于比色皿的壁上 ,實(shí)驗(yàn)證明這種蛋白 染料復(fù)合物的吸附的影響是可以忽略的 ,實(shí)驗(yàn)完畢后用乙醇可以將藍(lán)色的比色皿清洗干凈。 高效液相色譜法是在經(jīng)典的液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。 ③ 高效：分離效能高。 此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長(zhǎng)，相互補(bǔ)充。 高效液相色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。然而在牛奶中摻入廉價(jià)的水解蛋白、其他動(dòng)物乳或者含氮有機(jī)化合物等新的摻假方式，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法 [2934]則難以檢出，現(xiàn)在的乳品檢測(cè)技術(shù)往往是等參假物出來(lái)后才能確定相對(duì)的檢測(cè)技術(shù)，因而不能未卜先知。主要選用考馬斯亮藍(lán)法 (Bradford法 ) [29,35]，雙縮脲法 [31]，與凱氏定氮法的結(jié)果進(jìn)行比較，從中找出最適合乳源蛋白質(zhì)測(cè)定的方法。 （ 2） 使用雙縮脲 (Lowry)法、 Bradford方法檢測(cè)牛奶中的蛋白質(zhì)的含量，并與國(guó)標(biāo)法結(jié)果進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)藥品：純牛奶、 96%濃硫酸、 40%(m/m)氫氧化鈉溶液、 20 g/L 的硼酸溶液、 、 無(wú)水 乙醇、中性甲基紅、亞甲藍(lán)溶液、硫酸鉀、五水硫酸銅、 30%過(guò)氧化氫、蒸餾水等。 4) 混合催化劑 ： 五水硫酸銅和硫酸鉀分別研碎 ,按 1:15 的比例混合均勻。 精密稱(chēng)取牛奶樣品（空白樣為加蒸餾水） 5 ml,小心放入干燥的凱氏燒瓶中 , 避免試樣附著在管壁；加入混合催化劑 10 g, 與試樣混合均勻； 再加入 25 mL 硫酸和 5 mL 的雙氧水；然后將燒瓶以 45176。 2) 堿化蒸餾。向小玻璃杯中加入 20～ 30 mL40%的氫氧化鈉溶液（過(guò)量），慢慢提起棒狀杯塞，使氫氧化鈉緩慢流入反應(yīng)室（防止反應(yīng)室氣體從杯塞處 外泄），立即塞緊棒狀杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸餾水使之密封。 4) 計(jì)算。 實(shí)驗(yàn)操作及步驟 試劑的準(zhǔn)備 雙縮脲試劑：稱(chēng)取沒(méi)有丟失結(jié)晶水的硫酸銅（ CuSO4 6%NaOH 溶液：先配成 NaOH 濃溶液，然后稀釋成 6%NaOH 溶液。 表 21 雙縮脲法測(cè)定方法中 牛奶中添加尿素溶液的配制 樣品編號(hào) 牛奶所占比例 牛奶 / mL 尿素溶液 / mL 1 100% 1 0 2 90% 3 80% 4 70% 5 50% 2）牛奶中摻入三聚氰胺溶液的摻假 樣品處理 根據(jù)凱氏定氮法測(cè)得的牛奶中的氮含量配置三聚氰胺溶液，使每毫升三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測(cè)得的牛奶的氮含量。 實(shí)驗(yàn)操作步驟 1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制 (1)取 6 支試管，編號(hào)，取出一支試管作為空白對(duì)照，然后 分別向其余的 5 支試管中準(zhǔn)確的 加入 0mL， mL， mL， mL， mL， mL濃度為 lmg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 ， 然后用蒸餾水分別將各試管補(bǔ)齊到 mL（如表 23 所示）。 (3)以用吸光度值 A550nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量 (mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 實(shí)驗(yàn)操作及步驟 試劑的準(zhǔn)備 考馬斯亮藍(lán) G250 溶液：稱(chēng)取 100mg 考馬斯亮藍(lán) G250，溶于 50 mL乙醇中，加入 100 mL 85%的磷酸，再用蒸餾水定容到 1 L，濾紙過(guò)濾。 取不同體積的牛奶 4 份，以樣品 1 作為對(duì)照樣，樣品 6~9 分別為 mL、 mL、 mL、 mL 的牛奶，然后向 2~5 號(hào)樣品中添加不同體積的三聚氰胺溶液，使得總體積都為 1 mL，配制的樣品編號(hào)及含量如表 25 所示。 實(shí)驗(yàn)操作步驟 1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制 (1)取 6 支試管，編號(hào)，取出一支試管作為空白對(duì)照， 然后分別向其余的 5 支試管中準(zhǔn)確的加入 0 mL， mL， mL， mL， mL， mL濃度為 l mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 ， 然后用蒸餾水分別將各試管補(bǔ)齊到 mL， 其添加方法 及順序如表 26 所示。 表 26 考馬斯亮藍(lán)法實(shí)驗(yàn)表 1 2 3 4 5 6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 /mL 0 蒸餾水 /mL 2）樣品中的蛋白含量測(cè)定 取 9 只試管并編號(hào)， 1~9 號(hào)試管中各按 中 2 中的順序?qū)?yīng)的取一定量的摻雜不同濃度并處理過(guò)的未知樣品，按照 1）中的測(cè)定方法，使未知樣品測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定范圍內(nèi)。 注：在本方法中所用的水均為超純水。再將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為 5 μg/mL、 25 μg/mL、 50 μg/mL、 75 μg/mL、 100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。稱(chēng)取 g 磷酸二氫鉀（準(zhǔn)確至 g），加 800 mL 水使其完全溶解后，再用磷酸調(diào)節(jié)為 pH=，用水稀釋至 1L，用 181。 色譜條件： 色譜柱： ZORBAX300SBC18色譜柱（ 250 mm mm， 5 μm） 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器 流動(dòng)相：乙腈：水 =5： 95 (體積比 ) 檢測(cè)波長(zhǎng)： 220 nm 流速： 1 mL/min 柱溫：室溫 進(jìn)樣體積： 10 μL 在上面的色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后注入尿素標(biāo)準(zhǔn) 系列溶液，記錄色譜峰面積，以尿素溶液的質(zhì)量濃度（ mg/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 取已知三聚氰胺或尿素含量的牛奶樣品，對(duì)應(yīng)的加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按 “ 樣品前處理 ” 操作，平行制備 3 份，得到樣品溶液后按上述色譜條件對(duì)應(yīng)的進(jìn)行進(jìn)樣分析。因此，凱 氏定氮法適合用于測(cè)定樣品的總 的氮含量。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制 依照 中表 23 的方法用 722 型光柵分光光度計(jì)測(cè)各濃度標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液在 550nm處的吸光度值 A550nm，測(cè)得的數(shù)值如表 33 所示。 雙縮脲法對(duì)摻雜尿素溶液的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理 依照 中 2）中的方法用 722 型光柵分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)各摻入不同比例的尿素溶液的未知樣品溶液在 550nm處的吸光度值 A550nm，測(cè)得的數(shù)值如表 34 所示。由此看來(lái)，使用雙縮脲法測(cè)定摻入尿素的牛奶樣品的方法基本準(zhǔn)確，但是該法測(cè)得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性第 3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 25 和重現(xiàn)性一般，因此需要通過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到多組數(shù) 據(jù)求平均值才可以得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果。 結(jié)果分析 從表 37可以看出牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液 用雙縮脲法檢測(cè)摻假的牛奶中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、 %， 其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 %、 %、 %、 %。根據(jù) 中得到的牛奶中的蛋白質(zhì)的濃度為 g/100mL，可以計(jì)算出 中 2 中牛奶樣品摻雜所需要的尿素溶液的濃度為 g/100mL，所需三聚氰胺溶液的濃度為 g/100mL。 圖 32 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖 32 所示，考馬斯亮藍(lán)法以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，由所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，其線性方程為 Y=－ ，相關(guān)系數(shù)為 R2=，這表明酪蛋白與考馬斯亮藍(lán) G250 試劑的線性關(guān)系好，因此可知考馬斯亮藍(lán)法所0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .00 .0 50 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .3 50 .4 0吸光度A595nm蛋 白 質(zhì)含量(100 μ g/mL)Y = 1 5 7 0 7 1R2= 2 3燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 28 需的標(biāo)準(zhǔn)蛋 白可以用酪蛋白。 表 39 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得的添加尿素溶液的樣品在 595nm 處的吸光度值 A595nm 試管編號(hào) 1 2 3 4 5 吸光度值 A595nm 結(jié)果分析 從表 35可以看出牛奶中摻入不同比例尿素溶液用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)摻假的牛奶 中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、 %,其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 %、 %、 %、 %。 [樣品體積 （ mL） 1000] 表 311 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得的添加三聚氰胺的未知樣品在 595nm 處的吸光度值 A595nm 試管編號(hào) 1 6 7 8 9 吸光度值 A595nm 計(jì)算可得考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表 312 所示。 反向高效液相色譜法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線和三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線 使用高效液相色譜儀，按照 中 3 中 1）的色譜條件對(duì) 中 1 中1）所處理好的不同濃度的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得的峰面積如表313 所示。 由此看來(lái)，使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定摻入三聚氰胺的牛奶樣品的方法與理論差值的誤差比較大，但是該法測(cè)得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此該方法可以不通過(guò)進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)就可以得到結(jié)果。 第 3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 29 表 310 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號(hào) 實(shí)測(cè)值 / g/L 平均值 / g/L 理論值 / g/L 誤差率/ % RSD/% 1 2 3 4 5 考馬斯亮藍(lán)法對(duì)摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理 同理可得 用 722 型光柵分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在 595nm 處的吸光度值 A595nm，測(cè)得的數(shù)值如表 311所示。 以根據(jù)表 39 中測(cè)得的 樣品的吸光度值在圖 32 所示的 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量 (mg)，代入下式： 蛋白質(zhì)含量（ mg/mL） =標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量 （ μg/mL) 500(mL) 247。 第 3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 27 表 38 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液在 595nm 處的吸光度值 A595nm 蛋白質(zhì)含量/ 100μg/mL 0 吸光度值A(chǔ)595nm 0 0 0 其對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)含量的吸光度的平均值分別為： 0、 、 、 、 。 考馬斯亮藍(lán)法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計(jì)算 中 2 中提到需要根據(jù)凱氏定氮法測(cè)得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液和三聚氰胺溶液，使每毫升尿素溶液和三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測(cè)得的牛奶的氮含量的方法對(duì)樣品進(jìn)行摻雜。 表 36 雙縮脲法測(cè)得的添加三聚氰胺溶液的樣品在 550nm 處的吸光度值 A550nm 試管編號(hào) 1 6 7 8 9 吸光度值A(chǔ)550nm 表 37 雙縮脲法測(cè)定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號(hào) 實(shí)測(cè)值 / g/L 平均值 / g/L 理論值 / g/L 誤差率/ % RSD/% 1 6 7 8 9 以根據(jù)表 36 中測(cè)得的 樣品的吸光度值在圖 31 所示的 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 26 對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量 (mg)，代入下式： 蛋白質(zhì)含量（ mg/mL） =標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量 （ mg/mL) 50(mL)247。 樣品體積（ mL） 計(jì)算可得雙縮脲法測(cè)定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表 35 所示。根據(jù)上述 數(shù)據(jù)作 蛋白質(zhì)含量 吸光度圖，得到 雙縮脲法