【正文】 縮脲法和考馬斯亮藍(lán)法要比凱氏定氮法簡便迅速，并且這兩種方法也都可以快速準(zhǔn)確的檢測出蛋白質(zhì)的含量。 Bradford method。而蛋白質(zhì)又是牛奶及奶制品中的主要成分，乳蛋白中含有大量的人體必需氨基酸，是人體細(xì)胞不可缺少的，也是牛乳中最重要的特征營養(yǎng)成分，因此，作為人們攝取蛋白質(zhì)的主要來源的奶制品深受人們的青睞。乳制品中的摻物的種類有很多種，如：水、米湯、豆?jié){、淀粉、蔗糖、食鹽、碳酸鈉、雙氧水、電解質(zhì)溶液、牛尿、尿素、三聚氰胺、植物油、陳乳、白礬、亞硝酸鹽、硝酸鹽、洗衣粉、抗生素、化肥等 [13]。雖然這些年來我們國家一直都在不停地打假治假，但是這種摻假造假的現(xiàn)象迄今都是禁而未止，摻雜使假的情況時不時的浮出水面，乳制品燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 2 的質(zhì)量安全問題也已經(jīng)引起了全社會的普遍關(guān)注。其中分光光度法又包括：雙縮脲法，考馬斯亮藍(lán)法，福林 酚試劑法、 BCA 法和紫外吸收法等，滴定 法包括有甲醛滴定法、 pH 滴定法等。 凱氏定氮法（其裝置圖如下圖 11）的基本原理是將含氮的有機(jī)物與濃 圖 11 凱氏定氮法消化、蒸餾裝置 硫酸共同加熱 ,反應(yīng)過程中樣品中的碳、氫等元素被氧化成二氧化碳和水而第 1章 緒論 3 逸出 ,有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨 ,并且進(jìn)一步與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，通常稱此過程為“消化”。 凱氏定氮法是測定待測樣品中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確的方法 ,也是各種蛋白質(zhì)含量測定方法的基礎(chǔ)。 在我國的國家標(biāo)準(zhǔn)中，凱氏定氮法測定的是總氮的含量，因此得到的結(jié)果代表的是乳品中粗蛋白的含量；而在國際標(biāo)準(zhǔn) (ISO， AOAC， IDF)中，先用三氯乙酸對樣品進(jìn)行預(yù)處理，使蛋白質(zhì)沉淀，然后再分別對沉淀中的蛋白態(tài)氮和濾液中的非蛋白態(tài)氮進(jìn)行凱氏定氮，測定的結(jié)果可真實(shí)反映乳品真蛋白的含量 [12]。 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 4 圖 12 紫色絡(luò)合物分子結(jié)構(gòu)式 由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。肽鍵是組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與 Cu2+作用生成紫紅色絡(luò)合物，且在一定條件下， 顏色的深淺程度與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，即 蛋白質(zhì)濃度隨著顏色的加深而呈增加的趨勢，且成正比關(guān)系， 而顏色的變化與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)， 因此我們可以通過雙縮脲法比色的方法來測定蛋白質(zhì)的濃度，這種方法也是常用的方法之一 [13]。 主要的干擾有： 酚類、檸檬酸、硫酸銨、 Trsi 緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等第 1章 緒論 5 均有干擾作用 [14]。 福林 酚試劑法（ Lowry 法） 福林 酚試劑法（ Lowry 法）是 Lowry 在雙縮脲方法的基礎(chǔ)上發(fā)展的。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是 :在堿性環(huán)境中 ,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子結(jié)合生成復(fù)合物；福林 酚試劑中的磷鋁酸鹽 磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原 ,產(chǎn)生深藍(lán)色 (鋁藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物 )。 對雙縮脈反應(yīng)發(fā)生干擾的離子 ,同樣容易干擾福林 酚反應(yīng)。 Bradford 在 1976 年根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計而建立了考馬斯亮藍(lán)法，這種測定蛋白質(zhì)的方法具有超過其他幾種方法的突出的優(yōu)點(diǎn) ,因而得到廣泛的應(yīng)用。通過測定在 595 nm 下的吸光度值 A595nm， 可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 （ 2） 優(yōu)缺點(diǎn) 考馬斯亮藍(lán)法的優(yōu)點(diǎn)在于它的靈敏度高。完成一個樣品的測定 , 只需加一種試劑，并且只需要 5 分鐘左右即可。由于不同種類的蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量分布不同 ,因此考馬斯亮藍(lán)法在測不同的蛋白質(zhì)時會有較大的偏差 ,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用 γ球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白以減少這方面的偏差 [23]。 高效液相色譜法（ HPLC） 高效液相色譜法（ High Performance Liquid Chromatography / HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜法是在高壓條件下，溶質(zhì)在固定相和流動相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換的過程，它借溶質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離 [26]?？蛇x擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。其中，正向色譜法是采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵 合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。 RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個 HPLC應(yīng)用的 80%左右。為此，急需建立適應(yīng)新?lián)郊偾闆r的快速、準(zhǔn)確的檢測方法。由于福林 酚試劑法對實(shí)驗(yàn)時間要求嚴(yán)格，而實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備條件不能達(dá)到要求，所以本課題中將不再用此方法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。 （ 3） 使用雙縮脲 (Lowry)法、 Bradford方法對于牛奶中摻入不同比例的尿素溶液、三聚氰胺溶液樣品，樣品經(jīng)前處理后，看能否準(zhǔn)確測定牛乳蛋白含量。 實(shí)驗(yàn)操作及步驟 試 劑的配制 1) 40%的氫氧化鈉溶液： 40 g 氫氧化鈉加蒸餾水定容至 100 mL。 5) 混合指示劑 ： %的甲基紅乙醇溶液（ g 甲基紅試劑溶于 20 mL無水乙醇 乙醇，稀釋至 100 mL） 20 mL 與 %亞甲基藍(lán)乙醇溶液（ 2 g 亞甲基藍(lán)定溶于 100 ml 無水乙醇中） 10 mL 混合搖勻。角斜放在支架上，用第 2章 實(shí)驗(yàn)材料及方法 11 電爐緩慢加熱，當(dāng)瓶內(nèi)泡沫消失后強(qiáng)熱至沸。 將消化好并冷卻至室溫的樣品溶液全部轉(zhuǎn)移到 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度搖勻。通入蒸汽 5 min，降低接收瓶位置使冷凝管末端離開液面后再繼續(xù)蒸餾 1 min，用少量蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。 根據(jù)所消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，計算出總的氮的含量，再乘以蛋白質(zhì)中氮的轉(zhuǎn)化系數(shù)即可得到樣品中的蛋白質(zhì)的含量。5H2O） 3 g，溶于 500 ml 新鮮制備的蒸餾水中，加入酒石酸鉀鈉 9 g，碘化鉀 5 g，攪拌至完全第 2章 實(shí)驗(yàn)材料及方法 13 溶解。 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 (1 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取 110 mg 的酪蛋白，加水溶解定溶至 100 mL 即為 l mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液。 取不同體積的牛奶 4 份，以樣品 1 作為對照樣，樣品 6~9 分別為 mL、 mL、 mL、 mL 的牛奶，然后向 6~9 號樣品中添加不同體積的三聚氰胺溶液，使得總體積都為 1 mL，配制的樣品編號及含量如表 22 所示。 再向分別各試管中加入 mL6%的氫氧化鈉溶液，最后分別向各試管中加入 mL 的雙縮脲試劑，每加完一管，立刻混合搖勻。 2）樣品中的蛋白含量測定 取 9 只試管并編號， 1~9 號試管中各按 中 2 中的順序?qū)?yīng)的取一第 2章 實(shí)驗(yàn)材料及方法 15 定量的摻雜不同濃度并處理過的未知樣品，按照 1）中的測定方法，使未知樣品測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定范圍內(nèi)。 摻雜樣品處理 1）牛奶中摻入尿素溶液的摻假樣品處理 根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液，使每毫升尿素溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量。 表 25 考馬斯亮藍(lán)測定方法中牛奶中添加三聚氰胺溶液的配制 樣品編號 牛奶所占比例 牛奶 / mL 三聚氰胺溶液 / mL 6 90% 7 80% 8 70% 9 50% 樣品前處理 向 1~6 號樣品中分別加入 13 mL 乙腈 和 5 mL 水 ，劇烈振蕩 6 min，充分混勻后靜置 10 min， 在 10000 r/min 轉(zhuǎn)速下，離心 20 min， 去上清液，沉第 2章 實(shí)驗(yàn)材料及方法 17 淀待用。 最后 再 分別向各試管中加入 5 mL 的考馬斯亮藍(lán) G250 溶液，每加完一管，立刻混合搖勻。根據(jù)所測定的 A595nm值，在 (3)中制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，再乘以稀釋倍數(shù)計算出原樣品中試 管 號 試 劑 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 18 的蛋白濃度 (mg/mL)。 實(shí)驗(yàn)操作及步驟 試劑的準(zhǔn)備 1）尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取 2 g 尿素標(biāo)準(zhǔn)品于 100 mL 容量瓶中配制成濃度為 mg/mL 的尿素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再分別稀釋為濃度為 1 mg/mL、 5 mg/mL、 10 mg/mL、 15 mg/mL、 20 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用 181。用 181。m的針式濾膜 過濾后備用。 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 20 2）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按以下色譜條件對三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測。 第 3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 21 第 3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 凱氏定氮法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理 根據(jù) 凱氏定氮法的分析步驟，所得結(jié)果如表 31 所示 表 31 凱氏定氮法試驗(yàn)數(shù)據(jù) 組號 樣品編號 V1/ mL 空白樣品編號 V2/ mL V1V2/ mL 1 1 4 2 2 5 3 3 6 表中： V1 為樣品消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積； V2 為空白樣消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積。 雙縮脲法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算 中 2 中提到需要根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液和三聚氰胺溶液，使每毫升尿素溶液和三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量的方法對樣品進(jìn)行摻雜。 表 33 雙縮脲法測得的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液在 550nm 處的吸光度值 A550nm 蛋白質(zhì)含量 / mg/mL 0 吸光度值 A550nm 0 0 0 第 3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 23 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .00 .10 .00 .10 .20 .30 .40 .50 .60 .70 .8吸光度A550nm蛋 白 質(zhì)含量（ mg/mL）Y = 0 5 1 0 . 0 1 2 1 8R2= 6 7 圖 31 雙縮脲法測得的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線 其對應(yīng)蛋白質(zhì)含量的吸光度的平均值分別為： 0、 、 、 、 。 以根據(jù)表 34 中測得的 樣品的吸光度值在圖 31 所示的 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量 (mg)，代入下式： 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 24 蛋白質(zhì)含量（ mg/mL） =標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量 （ mg/mL)50(mL) 247。 雙縮脲法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理 同理可得 用 722 型光柵分光光度計進(jìn)行測各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在 550nm處的吸光度值 A550nm，測得的數(shù)值如表 36 所示。由此看來，使用雙縮脲法測定摻入三聚氰胺的牛奶樣品的方法比較準(zhǔn)確，該法測得的數(shù)據(jù)的數(shù)值上的差異也不是很大，因此如通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到多組數(shù)據(jù)求平均值可以得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制 依照 中表 26 的方法用 722 型光柵分光光度計測各濃度標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液在 595nm處的吸光度值 A595nm，測得的數(shù)值如表 38 所示。 考馬斯亮藍(lán)法對摻雜尿素的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理 依照 中 2）中的方法用 722 型光柵分光光度計進(jìn)行測各摻入不同比例的尿素溶液的未知樣品溶液在 595nm處的吸光度值 A595nm，測得的數(shù)值如表 39 所示。 由此看來，使用考馬斯亮藍(lán)法測定摻入尿素的牛奶樣品的方法與理論差值的誤差比較大，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此該方法可以不通過進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)就可以得到結(jié)果。 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 30 表 312 考馬斯亮藍(lán)法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號 實(shí)測值 / g/L 平均值/ g/L 理論值/ g/L 誤差率/ % RSD/% 1 6 7 8 9 結(jié)果分析 從表 312 可以看出牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液用考馬斯亮藍(lán)法檢測摻假的牛奶中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、%， 其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 %、 %、 %、 %。 第 3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 31