【正文】 莉、羅琛、汪洋、鄭康、李忠、李志、魏麗華 經(jīng)費(fèi)比例： 25% 課題 2 魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚(yú)類(lèi)下丘腦 /垂體控制生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚(yú)類(lèi)性成熟和生長(zhǎng)的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理；闡明腦腸肽 /生長(zhǎng)激素 /類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路及其對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制；揭示卵泡抑素等抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚(yú)類(lèi)肌肉細(xì)胞增殖和魚(yú)肉蛋白 /脂肪平衡的作用機(jī)理；研制出可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系；闡明魚(yú)類(lèi)個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律；開(kāi)拓生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標(biāo)記尤其是主控基 因用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 2) 精干、務(wù)實(shí)的研究團(tuán)隊(duì)，成效突出： 本項(xiàng)目集中了中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院、中山大學(xué)、浙江大學(xué)、武漢大學(xué)等相關(guān)科研單位和高等院校在本領(lǐng)域的優(yōu)秀人才，具有強(qiáng)烈的使命感和責(zé)任感，經(jīng)過(guò)五年的合作，已取得了相當(dāng)高的學(xué)術(shù)成績(jī)，主要學(xué)術(shù)帶頭人在項(xiàng)目執(zhí)行過(guò)程中發(fā)表了高水平的學(xué)術(shù)論文 ，有的還獲得國(guó)家杰出青年科學(xué)基金資助，已形成一支經(jīng)過(guò)磨練、對(duì)科學(xué)有執(zhí)著追求、精干、務(wù)實(shí)、高效的研究團(tuán)隊(duì)，成為本項(xiàng)目順利實(shí)施的人才保證。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin immunoprecitation， ChIP）、凝膠遷移或電泳遷移率檢測(cè)（ Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）等技術(shù)研究 DNA與蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（ Coimmunoprecipitation， CoIP）、 GSTpull down、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、雙分子熒光互補(bǔ)（ bimolecular fluorescence plementation， BiFC）等技術(shù)研究蛋白相互作用； 對(duì)一些重要蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析、并對(duì)其進(jìn)行泛素化、乙?；土姿峄刃揎椃治?； 8. 鑒定兩性生殖鯽魚(yú)卵子中雙親特異性甲基化、發(fā)育不等性基因， 分析單性生殖鯽魚(yú)三倍體卵子中相關(guān)同源基因啟動(dòng)子 CpG 島甲基化差異和基因表達(dá)調(diào)節(jié)差異，確定發(fā)生差異甲基化的目標(biāo)基因；比較分析兩性生殖與單性生殖鯽魚(yú)卵子基因組中差異甲基化功能基因啟動(dòng)子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。 采用大規(guī)模測(cè)序和基因芯片分析等手段，通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因功能分析等研究手段，解析魚(yú)類(lèi)抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，揭示低溫脅迫下不耐寒魚(yú)類(lèi)基因表達(dá)譜與耐寒魚(yú)類(lèi)基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；創(chuàng)制魚(yú)類(lèi)抗寒機(jī)理研究模型，開(kāi)拓魚(yú)類(lèi)抗寒基因用于分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 4）魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 通過(guò)建立魚(yú)類(lèi)數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息 整合技術(shù)和魚(yú)類(lèi)經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚(yú)類(lèi)經(jīng)濟(jì)性狀主效基因同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系，闡明魚(yú)類(lèi)經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們?cè)谌后w和家系中的功能，確定魚(yú)類(lèi)經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記和基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評(píng)估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。 9. 采用正常的和人工突變后的基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，輔以其它分子生物學(xué)方法如目的基因表達(dá)產(chǎn)物體內(nèi)、外誘導(dǎo)處理等來(lái)分析目的基因的生理功能； 10. 用顯微注射方法研究基因功能。 3) 堅(jiān)實(shí)、完善的研究基地，支撐有力： 本項(xiàng)目利用淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、有害生物控制和資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和多個(gè)部門(mén)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室研究基地的研究條件，這些實(shí)驗(yàn)室擁有完善的一流研究設(shè)備，先進(jìn)的研究條件，是順利完成本項(xiàng)目的堅(jiān)實(shí)支撐和重要物質(zhì)基礎(chǔ)。 主要研究?jī)?nèi)容： 魚(yú)類(lèi)下丘腦 /垂體的功能基因組以及魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究； 魚(yú)類(lèi)性成熟和生長(zhǎng)的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理研究； 腦腸肽 /生長(zhǎng)激素 /類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路和對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制研究； 抑肌素信號(hào)調(diào)控在魚(yú)類(lèi)肌肉細(xì)胞增殖和蛋白 /脂肪平衡中作用機(jī)理研究； 可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系研制及其生理學(xué)功能分析； 魚(yú)類(lèi)個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律研究； 生長(zhǎng)調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑研究。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、武漢大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 孫永華 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 肖武漢 、 劉靜霞 、 程漢華 、 王燕舞 、 羅大極 、 劉江東 、 曹宏 經(jīng)費(fèi)比例： 17% 四、年度計(jì)劃 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)基因組 BAC 文庫(kù)構(gòu)建以及與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 抑肌素信號(hào)表達(dá)水平改 變對(duì)魚(yú)體肌肉生長(zhǎng)的調(diào)控研究； 4. 細(xì)菌病和病毒性疾病抗性群體和易感群體的篩選和建立； 5. 抗寒候選基因 的 轉(zhuǎn)基因操作研究 ； 6. 鯉魚(yú) QTL 分析家系的建立及其多態(tài)性微衛(wèi)星和 SNP 等遺傳標(biāo)記的發(fā)掘篩選和驗(yàn)證； 7. 魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)和抗病等經(jīng)濟(jì)性狀 QTL和主效基因的信息收集與分析整合； 8. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn) 和 基因敲除載體系統(tǒng) 的改造 ； 9. 持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的分子設(shè)計(jì) ， 原生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因的鑒定 ，小 RNA 的分離、克隆 和 深度測(cè)序。 子代親本 2020 尾以上；分析鯉魚(yú) QTL或主效基因的聚合效應(yīng)、育種效率與潛力； 8. 獲得可用于原生殖細(xì)胞操作的、的基因操作載體 ， 獲得具有表型效應(yīng)的基因敲除的純合子個(gè)體； 9. 獲得轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長(zhǎng)激素受體基因魚(yú) F2 代 ， 獲得原生質(zhì)細(xì) 胞發(fā)育被影響的轉(zhuǎn)基因胚胎 ， 揭示小 RNA 及其互作蛋白和靶基因的相互作用。 1. 重點(diǎn)闡明 23 個(gè)重要功能基因在殖質(zhì)的形成和遷移、卵子成熟、卵胚轉(zhuǎn)換和性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 獲得 35 個(gè)重要的通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)軸因子和育性調(diào)控的轉(zhuǎn)基因養(yǎng)殖或模式魚(yú)品系，用以開(kāi)展個(gè)體促生長(zhǎng)、改善肉質(zhì)等經(jīng)濟(jì)性狀改良的研究平臺(tái)； 3. 闡明 23 個(gè)重要基因在病毒感染識(shí)別以及抗病毒信號(hào)傳遞中的作用機(jī)理；闡明 23 個(gè)重要基因在細(xì)菌感染識(shí)別等信號(hào)傳遞中的作用機(jī)理； 5. 建立主要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因組研究和分子設(shè)計(jì)育種中間的有機(jī)聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個(gè)在生殖、生 長(zhǎng) 或抗性等目標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 路線和策略； 7. 建立優(yōu)化和完善的基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚(yú)類(lèi)基因快速敲除系統(tǒng)； 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 8. 穩(wěn)定遺傳、快速生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長(zhǎng)激素受體基因魚(yú)家系的建立 ，創(chuàng)制原生殖細(xì)胞操作技術(shù)和可控不育遺傳安全的轉(zhuǎn)基因魚(yú)模型 ， 闡明小RNA 分子在性分化過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)理。 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 二 年 1. 重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)基因組 BAC 文庫(kù)以及與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)組織的比較轉(zhuǎn)錄組 的進(jìn)一步 分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)與生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因的克隆及其分子標(biāo)記篩選 ； 3. 差異順式調(diào)控序列與相關(guān)基因啟動(dòng)子差異甲基化修飾的關(guān)系分析； 4. 可控性卵巢發(fā)育抑制轉(zhuǎn)基因魚(yú)類(lèi)模式品系的構(gòu)建； 5. 抑肌素信號(hào)通路研究 ； 6. 牙鲆抗病性狀關(guān)聯(lián)分析基礎(chǔ)群體和 QTL 作圖群體構(gòu)建； 7. 抗 寒基因轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)研究 及 子一代 的 耐寒性能評(píng)估 ； 8. 遺傳圖譜構(gòu)建及其鯉魚(yú) QTL 或主效基因在染色體上的同線性分析； 9. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率比較， Cre/lox 基因靶位操作效率分析 ， 基因