【正文】 莉、羅琛、汪洋、鄭康、李忠、李志、魏麗華 經(jīng)費比例： 25% 課題 2 魚類生長基因調(diào)控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究 主要研究目標： 闡明魚類下丘腦 /垂體控制生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡；揭示魚類性成熟和生長的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機理；闡明腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路及其對魚類生長的調(diào)控機制；揭示卵泡抑素等抑肌素相關基因在調(diào)控魚類肌肉細胞增殖和魚肉蛋白 /脂肪平衡的作用機理；研制出可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系；闡明魚類個體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進化規(guī)律；開拓生長基因調(diào)控網(wǎng)絡和分子標記尤其是主控基 因用于魚類分子設計育種的可行性途徑。 2) 精干、務實的研究團隊，成效突出： 本項目集中了中國科學院、中國水產(chǎn)科學研究院、中山大學、浙江大學、武漢大學等相關科研單位和高等院校在本領域的優(yōu)秀人才，具有強烈的使命感和責任感，經(jīng)過五年的合作，已取得了相當高的學術成績，主要學術帶頭人在項目執(zhí)行過程中發(fā)表了高水平的學術論文 ，有的還獲得國家杰出青年科學基金資助，已形成一支經(jīng)過磨練、對科學有執(zhí)著追求、精干、務實、高效的研究團隊，成為本項目順利實施的人才保證。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細胞和亞細胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin immunoprecitation， ChIP）、凝膠遷移或電泳遷移率檢測（ Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）等技術研究 DNA與蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（ Coimmunoprecipitation， CoIP）、 GSTpull down、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、雙分子熒光互補（ bimolecular fluorescence plementation， BiFC）等技術研究蛋白相互作用； 對一些重要蛋白進行質(zhì)譜分析、并對其進行泛素化、乙酰化和磷酸化等修飾分析； 8. 鑒定兩性生殖鯽魚卵子中雙親特異性甲基化、發(fā)育不等性基因， 分析單性生殖鯽魚三倍體卵子中相關同源基因啟動子 CpG 島甲基化差異和基因表達調(diào)節(jié)差異，確定發(fā)生差異甲基化的目標基因；比較分析兩性生殖與單性生殖鯽魚卵子基因組中差異甲基化功能基因啟動子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。 采用大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學和基因功能分析等研究手段，解析魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡及其作用機理，揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達譜與耐寒魚類基因表達譜的差異及其關鍵基因的功能；創(chuàng)制魚類抗寒機理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設計育種的可行性途徑。 4）魚類分子設計育種的關鍵技術研究 通過建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡信息 整合技術和魚類經(jīng)濟性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚類經(jīng)濟性狀主效基因同線性和性狀關聯(lián)性關系，闡明魚類經(jīng)濟性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們在群體和家系中的功能，確定魚類經(jīng)濟性狀主效基因標記和基因不同組合的遺傳效應，評估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚類分子設計育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術路線。 9. 采用正常的和人工突變后的基因轉(zhuǎn)移試驗，輔以其它分子生物學方法如目的基因表達產(chǎn)物體內(nèi)、外誘導處理等來分析目的基因的生理功能； 10. 用顯微注射方法研究基因功能。 3) 堅實、完善的研究基地，支撐有力： 本項目利用淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室、有害生物控制和資源利用國家重點實驗室和多個部門重點開放實驗室研究基地的研究條件，這些實驗室擁有完善的一流研究設備，先進的研究條件，是順利完成本項目的堅實支撐和重要物質(zhì)基礎。 主要研究內(nèi)容： 魚類下丘腦 /垂體的功能基因組以及魚類生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡研究； 魚類性成熟和生長的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機理研究； 腦腸肽 /生長激素 /類胰島素生長因子信號通路和對魚類生長調(diào)控機制研究； 抑肌素信號調(diào)控在魚類肌肉細胞增殖和蛋白 /脂肪平衡中作用機理研究； 可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系研制及其生理學功能分析； 魚類個體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進化規(guī)律研究； 生長調(diào)控基因和分子標記用于魚類分子設計育種的可行性途徑研究。 承 擔 單 位 ： 中國科學院水生生物研究所、武漢大學 課題負責人 ： 孫永華 主要學術骨干 ： 肖武漢 、 劉靜霞 、 程漢華 、 王燕舞 、 羅大極 、 劉江東 、 曹宏 經(jīng)費比例： 17% 四、年度計劃 年度 研究內(nèi)容 預期目標 第 一 年 1. 重要養(yǎng)殖魚類基因組 BAC 文庫構建以及與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟性狀相關組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟性狀相關功能基因的克隆及其分子標記篩選 ； 3. 抑肌素信號表達水平改 變對魚體肌肉生長的調(diào)控研究； 4. 細菌病和病毒性疾病抗性群體和易感群體的篩選和建立； 5. 抗寒候選基因 的 轉(zhuǎn)基因操作研究 ； 6. 鯉魚 QTL 分析家系的建立及其多態(tài)性微衛(wèi)星和 SNP 等遺傳標記的發(fā)掘篩選和驗證； 7. 魚類生長和抗病等經(jīng)濟性狀 QTL和主效基因的信息收集與分析整合； 8. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導的轉(zhuǎn)基因試驗 和 基因敲除載體系統(tǒng) 的改造 ； 9. 持續(xù)激活的生長激素受體基因的分子設計 ， 原生殖細胞特異表達基因的鑒定 ，小 RNA 的分離、克隆 和 深度測序。 子代親本 2020 尾以上；分析鯉魚 QTL或主效基因的聚合效應、育種效率與潛力； 8. 獲得可用于原生殖細胞操作的、的基因操作載體 ， 獲得具有表型效應的基因敲除的純合子個體； 9. 獲得轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長激素受體基因魚 F2 代 ， 獲得原生質(zhì)細 胞發(fā)育被影響的轉(zhuǎn)基因胚胎 ， 揭示小 RNA 及其互作蛋白和靶基因的相互作用。 1. 重點闡明 23 個重要功能基因在殖質(zhì)的形成和遷移、卵子成熟、卵胚轉(zhuǎn)換和性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡； 2. 獲得 35 個重要的通過調(diào)控生長軸因子和育性調(diào)控的轉(zhuǎn)基因養(yǎng)殖或模式魚品系，用以開展個體促生長、改善肉質(zhì)等經(jīng)濟性狀改良的研究平臺； 3. 闡明 23 個重要基因在病毒感染識別以及抗病毒信號傳遞中的作用機理；闡明 23 個重要基因在細菌感染識別等信號傳遞中的作用機理； 5. 建立主要經(jīng)濟性狀功能基因組研究和分子設計育種中間的有機聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個在生殖、生 長 或抗性等目標經(jīng)濟性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 路線和策略； 7. 建立優(yōu)化和完善的基于蛋白質(zhì)鋅指結構的魚類基因快速敲除系統(tǒng)； 年度 研究內(nèi)容 預期目標 8. 穩(wěn)定遺傳、快速生長的轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長激素受體基因魚家系的建立 ，創(chuàng)制原生殖細胞操作技術和可控不育遺傳安全的轉(zhuǎn)基因魚模型 ， 闡明小RNA 分子在性分化過程的分子調(diào)控機理。 年度 研究內(nèi)容 預期目標 第 二 年 1. 重要養(yǎng)殖魚類基因組 BAC 文庫以及與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟性狀相關組織的比較轉(zhuǎn)錄組 的進一步 分析； 2. 重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟性狀相關功能基因的克隆及其分子標記篩選 ； 3. 差異順式調(diào)控序列與相關基因啟動子差異甲基化修飾的關系分析； 4. 可控性卵巢發(fā)育抑制轉(zhuǎn)基因魚類模式品系的構建； 5. 抑肌素信號通路研究 ； 6. 牙鲆抗病性狀關聯(lián)分析基礎群體和 QTL 作圖群體構建； 7. 抗 寒基因轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究 及 子一代 的 耐寒性能評估 ； 8. 遺傳圖譜構建及其鯉魚 QTL 或主效基因在染色體上的同線性分析； 9. 多種轉(zhuǎn)座子元件介導的轉(zhuǎn)基因效率比較， Cre/lox 基因靶位操作效率分析 ， 基因