【正文】 制，分析它們對魚類生殖和生長的影響； 14. 通過體外合成小分子 RNA，建立魚類系統(tǒng)中適用于實驗室日常工作的、簡潔、高效的 siRNA 技術(shù)平臺；通過克隆獲得的魚類來源的啟動子構(gòu)建針對草魚出血病病毒的 siRNA 載體，建立抗病轉(zhuǎn) siRNA 基因魚模型；通過 Creloxp 介導(dǎo)的系統(tǒng)進行魚類胚胎中的條件基因打靶研究；建立魚類胚胎干細胞和生殖干細胞系，建立魚類培養(yǎng)細胞體外基因操作和個體重建技術(shù)途徑； 15. 通過 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降技術(shù)，配合整體原位雜交、細胞示蹤等方法，研究目的基因的生理 學(xué)功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、信號通路和作用機理等； 16. 采用已經(jīng)建立的細胞模型，研究病毒與宿主細胞的相互作用，在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染目的基因和 siRNA 干擾等技術(shù)手段，研究目的基因的生理學(xué)功能以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 17. 通過 AFLP 和微衛(wèi)星等遺傳標(biāo)記的大規(guī)模篩選，鑒定出與魚類性別等等主要經(jīng)濟性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，進而通過 Genomic walking 克隆鑒定相關(guān)功能基因；通過人工選育和家系分析，利用遺傳標(biāo)記進行基因型分析的優(yōu)勢，研究特定標(biāo)記與某些經(jīng)濟性狀（例如生長、性別、抗病或抗寒）的連鎖關(guān)系，進行分子標(biāo) 記輔助育種；開展魚類生長、飼料轉(zhuǎn)化率等經(jīng)濟性狀的 QTL 定位分析和eQTL 定位分析； 18. 改造基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除載體系統(tǒng)，優(yōu)化基因敲除載體，引入更多的克隆位點，以簡化特異基因敲除載體的構(gòu)建；利用 Zinc Finger Tools 網(wǎng)上軟件包（ ） ,選取代表性基因進行鋅指結(jié)構(gòu)域的索尋，選擇連續(xù) 20 或 30 個氨基酸的合適結(jié)構(gòu)域，依據(jù)針對 DNA 三聯(lián)體的經(jīng)驗鋅指氨基酸序列，設(shè)計靶標(biāo)多肽和堿基序列；將靶標(biāo)多肽的 DNA 片段克隆到經(jīng)改進后的基因敲除載體上；體外合成 mRNA,顯微注射；觀察表型，并利用 PCR 檢測顯微注射個體的基因型，獲得雜合體；將雜合體個體擴大培養(yǎng)，并進行相互交配，以獲得基因的兩個拷貝均缺失的純合體；系統(tǒng)分析基因缺失純合體的表型。 （四）、可行性分析： 1) 厚實的前期研究基礎(chǔ)，目標(biāo)明確： 魚類等水產(chǎn)動物的分子設(shè)計育種研究雖然還處于起步階段，但可喜的是，隨著斑馬魚、河 鲀 和青 鳉 等模式魚類全基因組測序的完成和基因功能研究的不斷深入，一些重要養(yǎng)殖魚類的功能基因組研究已進展很快，特別是我們這個團隊在上一期 973 計劃 “ 重要魚 類品種改良的遺傳和發(fā)育基礎(chǔ)研究 ” 的支持下，已篩選鑒定出一批與我國主要養(yǎng)殖魚類的生殖、生長、抗性等經(jīng)濟性狀相關(guān)的基因和分子標(biāo)記，建立了 10 多個養(yǎng)殖魚類細胞系， 積累了 厚實的前期研究基礎(chǔ)。 （五）、 課題設(shè)置 圍繞項目所要解決的魚類分子設(shè)計育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計育種的 可行性途徑這兩個 關(guān)鍵科學(xué)問題，以 及項目所要達到為魚類分子設(shè)計育種的實踐與應(yīng)用和為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展與漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻的預(yù)期目標(biāo)，根據(jù)項目所要進行的主要研究內(nèi)容（研究魚類生殖、生長、抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機理，篩選鑒定可用于分子設(shè)計育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚類分子設(shè)計育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系），項目共設(shè)置 6 個課題。 課題 1 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 解析魚類生殖質(zhì) (germ plasm)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示魚類生殖質(zhì)主要成分的功能及其作用機制；闡明魚類配子發(fā)生過程中雙親特異性甲基化在生殖調(diào)控中的作用及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚類卵母細胞特異組蛋白、 Spindlin等與魚類卵子成熟調(diào)控和卵 胚轉(zhuǎn)換機制；揭示魚類性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機理；篩選鑒定出可用于魚類分子設(shè)計育種的性別特異表達基因和分子標(biāo)記；開拓生殖調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計育 種的可行性途徑。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國科學(xué)院水生生物研究所、中山大學(xué) 課題負責(zé)人 ： 殷戰(zhàn) 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 林浩然 、 李文笙 、黃安林、 賀江燕、 王緒禎 、 陳尚萍 經(jīng)費比例： 16% 課題 3 魚類抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抗病作用機理；揭示在魚類抗病免疫反應(yīng)中主效基因的表達調(diào)控機制；闡明重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制；研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設(shè) 計育種的理論和技術(shù)方法，開拓其可行性途徑； 主要研究內(nèi)容： 魚類干擾素系統(tǒng)基因的功能解析、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用機理研究； 重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制研究； 魚類抗細菌免疫基因的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能分析和抗病機理研究； 具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系的創(chuàng)制和篩選； 與抗病性狀相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因的鑒定及其抗病 QTL 定位研究； 魚類抗病分子設(shè)計育種的理論和技術(shù)方法的建立及其可行性途徑研究。 主要研究內(nèi)容： 魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息整合技術(shù)研究； 魚類經(jīng)濟性狀主效基因的圖譜定位、同線性和性狀關(guān)聯(lián)性研究； 魚類經(jīng)濟性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組分析以及在群體和家系中的功能研究； 魚類主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)與育種效率評估研究； 可用于魚類分子設(shè)計育種的多基因聚合技術(shù)研究。 1. 解析重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟性狀 相關(guān)組織的轉(zhuǎn)錄組信息； 2. 鑒定調(diào)控魚類生殖、生長、抗病和抗寒的功能基因或分子標(biāo)記 610個； 3. 構(gòu)建在養(yǎng)殖魚類肌肉組織中高表達抑肌素抑制蛋白的轉(zhuǎn)基因魚 F0代； 4. 建立牙鲆細菌病抗性群體和易感群體； 5. 建立轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的抗寒候選基因轉(zhuǎn)移體系，使候選基因在子一代魚中出現(xiàn)的頻率比用質(zhì)粒轉(zhuǎn)移提高 3倍以上 ； 6. 獲得多基因性狀基因遺傳分析的鯉魚家系材料 910 個，獲得微衛(wèi)星和 SNP 約 2020 個， AFLP 標(biāo)記 1000多個； 7. 獲得多種轉(zhuǎn)座子元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因魚 ， 獲得三聯(lián)體鋅指蛋白表達質(zhì)粒和哺乳動物細 胞系單雜交系統(tǒng)特異性檢測質(zhì)粒； 8. 獲得魚類生長激素受體基因及其持續(xù)激活形式的分子設(shè)計 ， 獲得原生質(zhì)細胞特異表達基因 ， 獲得性腺相關(guān)的小 RNA。 年度 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 三 年 1. 魚類生殖、生長、抗病和抗寒的重要基因的功能分析； 2. 基因啟動子的差異甲基化修飾在表達和生殖調(diào)控中的作用研究； 3. 不同尺寸魚類物種的分子系統(tǒng)學(xué)分析； 4. 創(chuàng)制育種上有價值的雌核發(fā)育系和近交家系； 5. 羅非魚轉(zhuǎn)抗寒基因研究 ； 6. 繼續(xù)遺傳圖譜構(gòu)建和 QTL 標(biāo)記或主效基因的基因型 表型的測量和分析； 7. 穩(wěn)定高效的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因模型和 Cre/lox 基因靶位操作模型的建立；基因敲除斑馬魚的 +/ 子代個體 的獲得 ； 8. 轉(zhuǎn)持續(xù)激活的生長激素受體基因魚 F1 代的篩選、鑒定及其信號通路活性分析 ， 原生殖細胞特異基因的分子設(shè)計和轉(zhuǎn)基因初步試驗 ， 小 RNA作用靶基因的研究，繼續(xù)互作蛋白的研究。 第 五 年 1. 重要功能基因的信號傳遞及其調(diào)控機制研究； 2. 在雌核發(fā)育和近交家系中候選QTL 與抗病力的關(guān)聯(lián)性分析； 3. 利用重要功能基因或分子標(biāo)記進行分子設(shè)計育種可行性評價； 4. 魚類主效基因標(biāo)記及基因不同組合的遺傳效應(yīng)與育種效率評估研究； 5. 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng) 的 完善和優(yōu)化； 6. 建立穩(wěn)定遺傳、快速生長的轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長激素受體基因魚家系 ， 建立原生殖細胞操作技術(shù)并獲得可控不育遺傳安全的轉(zhuǎn)基因魚 ， 小 RNA分子在性分化過程的分子調(diào)控機理