【正文】 磷酸化等修飾分析； 8. 鑒定兩性生殖鯽魚卵子中雙親特異性甲基化、發(fā)育不等性基因， 分析單性生殖鯽魚三倍體卵子中相關(guān)同源基因啟動子 CpG 島甲基化差異和基因表達(dá)調(diào)節(jié)差異，確定發(fā)生差異甲基化的目標(biāo)基因；比較分析兩性生殖與單性生殖鯽魚卵子基因組中差異甲基化功能基因啟動子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。將含有這些基因的真核表達(dá)載體，或在大腸桿菌中表達(dá)出的蛋白，注射到胚胎中或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 11. 將目的基因的反義 RNA或其蛋白的抗體注射到胚胎中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 12. 對生殖調(diào)控基因而言，設(shè)立人工性反轉(zhuǎn)實驗，分別提取不同性反轉(zhuǎn)階段實驗組和對照組性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表達(dá)的時序性； 13. 對生長和生殖功能基因而言，合成重要調(diào)控生長生殖基因的結(jié)構(gòu)類似物或表達(dá)具有生物活性重組蛋白，取魚類的下丘腦、垂體、肝臟和性腺，通過碎片灌流和細(xì)胞孵育等離體研究方法，或直接注射結(jié)構(gòu)類似物或重組蛋白，采用放射免疫測定等方法研究其活性，測定各種靶組織、血清中調(diào)控生殖生長激素的含量，分析這些生長調(diào)控因子和生殖調(diào)控因子的相互作 用及其信號傳遞機(jī)制，分析它們對魚類生殖和生長的影響； 14. 通過體外合成小分子 RNA，建立魚類系統(tǒng)中適用于實驗室日常工作的、簡潔、高效的 siRNA 技術(shù)平臺；通過克隆獲得的魚類來源的啟動子構(gòu)建針對草魚出血病病毒的 siRNA 載體，建立抗病轉(zhuǎn) siRNA 基因魚模型；通過 Creloxp 介導(dǎo)的系統(tǒng)進(jìn)行魚類胚胎中的條件基因打靶研究；建立魚類胚胎干細(xì)胞和生殖干細(xì)胞系，建立魚類培養(yǎng)細(xì)胞體外基因操作和個體重建技術(shù)途徑； 15. 通過 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降技術(shù)，配合整體原位雜交、細(xì)胞示蹤等方法，研究目的基因的生理 學(xué)功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、信號通路和作用機(jī)理等； 16. 采用已經(jīng)建立的細(xì)胞模型，研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染目的基因和 siRNA 干擾等技術(shù)手段，研究目的基因的生理學(xué)功能以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 17. 通過 AFLP 和微衛(wèi)星等遺傳標(biāo)記的大規(guī)模篩選，鑒定出與魚類性別等等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)而通過 Genomic walking 克隆鑒定相關(guān)功能基因；通過人工選育和家系分析，利用遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因型分析的優(yōu)勢，研究特定標(biāo)記與某些經(jīng)濟(jì)性狀（例如生長、性別、抗病或抗寒）的連鎖關(guān)系，進(jìn)行分子標(biāo) 記輔助育種；開展魚類生長、飼料轉(zhuǎn)化率等經(jīng)濟(jì)性狀的 QTL 定位分析和eQTL 定位分析； 18. 改造基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除載體系統(tǒng)，優(yōu)化基因敲除載體，引入更多的克隆位點，以簡化特異基因敲除載體的構(gòu)建；利用 Zinc Finger Tools 網(wǎng)上軟件包（ ） ,選取代表性基因進(jìn)行鋅指結(jié)構(gòu)域的索尋，選擇連續(xù) 20 或 30 個氨基酸的合適結(jié)構(gòu)域，依據(jù)針對 DNA 三聯(lián)體的經(jīng)驗鋅指氨基酸序列，設(shè)計靶標(biāo)多肽和堿基序列；將靶標(biāo)多肽的 DNA 片段克隆到經(jīng)改進(jìn)后的基因敲除載體上；體外合成 mRNA,顯微注射；觀察表型，并利用 PCR 檢測顯微注射個體的基因型，獲得雜合體；將雜合體個體擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行相互交配，以獲得基因的兩個拷貝均缺失的純合體；系統(tǒng)分析基因缺失純合體的表型。 2) 獨特的研究體系，注重發(fā)揮中國特色和優(yōu)勢： 銀鯽多倍體的遺傳背景和同時具有的雌核發(fā)育生殖和有性生殖雙重生殖方式以及性逆轉(zhuǎn)魚類奇特的性別分化現(xiàn)象為解析魚類生殖和性控的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了 新穎、 獨特的研究體系，有利于發(fā)揮我國的特色和優(yōu)勢。 （四）、可行性分析： 1) 厚實的前期研究基礎(chǔ)，目標(biāo)明確： 魚類等水產(chǎn)動物的分子設(shè)計育種研究雖然還處于起步階段，但可喜的是，隨著斑馬魚、河 鲀 和青 鳉 等模式魚類全基因組測序的完成和基因功能研究的不斷深入，一些重要養(yǎng)殖魚類的功能基因組研究已進(jìn)展很快，特別是我們這個團(tuán)隊在上一期 973 計劃 “ 重要魚 類品種改良的遺傳和發(fā)育基礎(chǔ)研究 ” 的支持下，已篩選鑒定出一批與我國主要養(yǎng)殖魚類的生殖、生長、抗性等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的基因和分子標(biāo)記，建立了 10 多個養(yǎng)殖魚類細(xì)胞系， 積累了 厚實的前期研究基礎(chǔ)。 2) 精干、務(wù)實的研究團(tuán)隊，成效突出： 本項目集中了中國科學(xué)院、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院、中山大學(xué)、浙江大學(xué)、武漢大學(xué)等相關(guān)科研單位和高等院校在本領(lǐng)域的優(yōu)秀人才，具有強烈的使命感和責(zé)任感，經(jīng)過五年的合作，已取得了相當(dāng)高的學(xué)術(shù)成績，主要學(xué)術(shù)帶頭人在項目執(zhí)行過程中發(fā)表了高水平的學(xué)術(shù)論文 ，有的還獲得國家杰出青年科學(xué)基金資助，已形成一支經(jīng)過磨練、對科學(xué)有執(zhí)著追求、精干、務(wù)實、高效的研究團(tuán)隊，成為本項目順利實施的人才保證。 （五）、 課題設(shè)置 圍繞項目所要解決的魚類分子設(shè)計育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計育種的 可行性途徑這兩個 關(guān)鍵科學(xué)問題，以 及項目所要達(dá)到為魚類分子設(shè)計育種的實踐與應(yīng)用和為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展與漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)的預(yù)期目標(biāo)，根據(jù)項目所要進(jìn)行的主要研究內(nèi)容（研究魚類生殖、生長、抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，篩選鑒定可用于分子設(shè)計育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚類分子設(shè)計育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系），項目共設(shè)置 6 個課題。 項目的主要研究內(nèi)容、課題設(shè)置和課題間的聯(lián)系 與項目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題和總體目標(biāo)的 學(xué)術(shù)思路圖 項目設(shè)置的 6 個課題是： 課題 1 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究； 課題 2 魚類生長基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究； 課題 3 魚類抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究； 課題 4 魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究； 課題 5 魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)研究； 魚類主要經(jīng)濟(jì)性狀的功能基因組 魚類生殖功能基因組 魚類分子設(shè)計育種的策略和理論基礎(chǔ) 魚類生長功能基因組 魚類抗性功能基因組 主要研究內(nèi)容 解決的關(guān)鍵科學(xué)問題 總體目標(biāo) 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 魚類生長基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的 基礎(chǔ)研究 魚類抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的 基礎(chǔ) 研究 魚類 抗寒基因 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的 基礎(chǔ)研究 課題設(shè)置的 思路 魚類分子設(shè)計育種的基因操作技術(shù)研究 魚類數(shù)量性狀多基因聚合 育種 技術(shù)研究 魚類分子設(shè)計育種的可行性途徑 魚類分子設(shè)計育種的實踐與應(yīng)用 課題 6 魚類分子設(shè)計育種的基因操作技術(shù)研究。 課題 1 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 解析魚類生殖質(zhì) (germ plasm)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示魚類生殖質(zhì)主要成分的功能及其作用機(jī)制；闡明魚類配子發(fā)生過程中雙親特異性甲基化在生殖調(diào)控中的作用及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚類卵母細(xì)胞特異組蛋白、 Spindlin等與魚類卵子成熟調(diào)控和卵 胚轉(zhuǎn)換機(jī)制；揭示魚類性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；篩選鑒定出可用于魚類分子設(shè)計育種的性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記；開拓生殖調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計育 種的可行性途徑。 承 擔(dān) 單 位 ： 中國科學(xué)院水生生物研究所、浙江大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人 ： 桂建芳 主要學(xué)術(shù)骨干 ： 周莉、羅琛、汪洋、鄭康、李忠、李志、魏麗華 經(jīng)費比例： 25% 課題 2 魚類生長基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計育種的基礎(chǔ)研究 主要研究目標(biāo)： 闡明魚類下丘腦 /垂體控制生長的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚