【正文】 第 五 年 1. 重要功能基因的信號傳遞及其調(diào)控機制研究； 2. 在雌核發(fā)育和近交家系中候選QTL 與抗病力的關聯(lián)性分析； 3. 利用重要功能基因或分子標記進行分子設計育種可行性評價； 4. 魚類主效基因標記及基因不同組合的遺傳效應與育種效率評估研究； 5. 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng) 的 完善和優(yōu)化； 6. 建立穩(wěn)定遺傳、快速生長的轉(zhuǎn)持續(xù)激活生長激素受體基因魚家系 ， 建立原生殖細胞操作技術并獲得可控不育遺傳安全的轉(zhuǎn)基因魚 ， 小 RNA分子在性分化過程的分子調(diào)控機理研究。 1. 解析重要養(yǎng)殖魚類與生殖、生長、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟性狀 相關組織的轉(zhuǎn)錄組信息； 2. 鑒定調(diào)控魚類生殖、生長、抗病和抗寒的功能基因或分子標記 610個； 3. 構(gòu)建在養(yǎng)殖魚類肌肉組織中高表達抑肌素抑制蛋白的轉(zhuǎn)基因魚 F0代； 4. 建立牙鲆細菌病抗性群體和易感群體； 5. 建立轉(zhuǎn)座子介導的抗寒候選基因轉(zhuǎn)移體系，使候選基因在子一代魚中出現(xiàn)的頻率比用質(zhì)粒轉(zhuǎn)移提高 3倍以上 ； 6. 獲得多基因性狀基因遺傳分析的鯉魚家系材料 910 個，獲得微衛(wèi)星和 SNP 約 2020 個， AFLP 標記 1000多個； 7. 獲得多種轉(zhuǎn)座子元件介導的轉(zhuǎn)基因魚 ， 獲得三聯(lián)體鋅指蛋白表達質(zhì)粒和哺乳動物細 胞系單雜交系統(tǒng)特異性檢測質(zhì)粒； 8. 獲得魚類生長激素受體基因及其持續(xù)激活形式的分子設計 ， 獲得原生質(zhì)細胞特異表達基因 ， 獲得性腺相關的小 RNA。 承 擔 單 位 ： 中國科學院水生生物研究所、中山大學 課題負責人 ： 殷戰(zhàn) 主要學術骨干 ： 林浩然 、 李文笙 、黃安林、 賀江燕、 王緒禎 、 陳尚萍 經(jīng)費比例： 16% 課題 3 魚類抗病基因調(diào)控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究 主要研究目標： 闡明魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡和抗病作用機理；揭示在魚類抗病免疫反應中主效基因的表達調(diào)控機制；闡明重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制；研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關的分子標記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設 計育種的理論和技術方法，開拓其可行性途徑； 主要研究內(nèi)容： 魚類干擾素系統(tǒng)基因的功能解析、調(diào)控網(wǎng)絡和作用機理研究； 重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制研究； 魚類抗細菌免疫基因的信號調(diào)控網(wǎng)絡、功能分析和抗病機理研究； 具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系的創(chuàng)制和篩選； 與抗病性狀相關的分子標記和等位基因的鑒定及其抗病 QTL 定位研究； 魚類抗病分子設計育種的理論和技術方法的建立及其可行性途徑研究。 （五）、 課題設置 圍繞項目所要解決的魚類分子設計育種的策略和理論基礎以及魚類分子設計育種的 可行性途徑這兩個 關鍵科學問題，以 及項目所要達到為魚類分子設計育種的實踐與應用和為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展與漁業(yè)生物技術的創(chuàng)新做出貢獻的預期目標，根據(jù)項目所要進行的主要研究內(nèi)容（研究魚類生殖、生長、抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡及其作用機理，篩選鑒定可用于分子設計育種的關鍵基因和分子標記，建立魚類分子設計育種的關鍵技術及其技術體系），項目共設置 6 個課題。將含有這些基因的真核表達載體，或在大腸桿菌中表達出的蛋白，注射到胚胎中或轉(zhuǎn)染到細胞中，觀察生物學效應； 11. 將目的基因的反義 RNA或其蛋白的抗體注射到胚胎中，觀察生物學效應； 12. 對生殖調(diào)控基因而言，設立人工性反轉(zhuǎn)實驗，分別提取不同性反轉(zhuǎn)階段實驗組和對照組性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表達的時序性； 13. 對生長和生殖功能基因而言，合成重要調(diào)控生長生殖基因的結(jié)構(gòu)類似物或表達具有生物活性重組蛋白，取魚類的下丘腦、垂體、肝臟和性腺，通過碎片灌流和細胞孵育等離體研究方法，或直接注射結(jié)構(gòu)類似物或重組蛋白，采用放射免疫測定等方法研究其活性，測定各種靶組織、血清中調(diào)控生殖生長激素的含量，分析這些生長調(diào)控因子和生殖調(diào)控因子的相互作 用及其信號傳遞機制，分析它們對魚類生殖和生長的影響； 14. 通過體外合成小分子 RNA，建立魚類系統(tǒng)中適用于實驗室日常工作的、簡潔、高效的 siRNA 技術平臺；通過克隆獲得的魚類來源的啟動子構(gòu)建針對草魚出血病病毒的 siRNA 載體，建立抗病轉(zhuǎn) siRNA 基因魚模型；通過 Creloxp 介導的系統(tǒng)進行魚類胚胎中的條件基因打靶研究；建立魚類胚胎干細胞和生殖干細胞系，建立魚類培養(yǎng)細胞體外基因操作和個體重建技術途徑； 15. 通過 morpholino 介導的基因敲降技術，配合整體原位雜交、細胞示蹤等方法，研究目的基因的生理 學功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡、信號通路和作用機理等； 16. 采用已經(jīng)建立的細胞模型，研究病毒與宿主細胞的相互作用，在此基礎上，通過轉(zhuǎn)染目的基因和 siRNA 干擾等技術手段，研究目的基因的生理學功能以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡； 17. 通過 AFLP 和微衛(wèi)星等遺傳標記的大規(guī)模篩選，鑒定出與魚類性別等等主要經(jīng)濟性狀相關的分子遺傳標記，進而通過 Genomic walking 克隆鑒定相關功能基因；通過人工選育和家系分析，利用遺傳標記進行基因型分析的優(yōu)勢，研究特定標記與某些經(jīng)濟性狀（例如生長、性別、抗病或抗寒）的連鎖關系，進行分子標 記輔助育種；開展魚類生長、飼料轉(zhuǎn)化率等經(jīng)濟性狀的 QTL 定位分析和eQTL 定位分析； 18. 改造基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除載體系統(tǒng)，優(yōu)化基因敲除載體，引入更多的克隆位點，以簡化特異基因敲除載體的構(gòu)建；利用 Zinc Finger Tools 網(wǎng)上軟件包（ ） ,選取代表性基因進行鋅指結(jié)構(gòu)域的索尋，選擇連續(xù) 20 或 30 個氨基酸的合適結(jié)構(gòu)域，依據(jù)針對 DNA 三聯(lián)體的經(jīng)驗鋅指氨基酸序列，設計靶標多肽和堿基序列；將靶標多肽的 DNA 片段克隆到經(jīng)改進后的基因敲除載體上；體外合成 mRNA,顯微注射；觀察表型，并利用 PCR 檢測顯微注射個體的基因型，獲得雜合體；將雜合體個體擴大培養(yǎng)，并進行相互交配，以獲得基因的兩個拷貝均缺失的純合體；系統(tǒng)分析基因缺失純合體的表型。 通過創(chuàng)制基于蛋白分子設計、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉(zhuǎn)基因技術，優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)，創(chuàng)建基于破壞原生殖細胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術體系 等建立可用于魚類分子設計育種的基因操作技術路線，并揭示性腺特異小 RNA 在基因表達調(diào)控中的作用，闡明 piRNA 與互作蛋白的調(diào)控途徑，研制出持續(xù)激活的生長激素受體基因的轉(zhuǎn)基因魚，揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長激素受體基因與轉(zhuǎn)生長激素基因的轉(zhuǎn)基因魚的效應及其信號通路的調(diào)控差異。 3） 魚類抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡和分子設計育種的基礎研究 利用我們自主建立的分離魚類抗病毒基因的細胞模型，重點解析魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡和抗病作用機理；揭示重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機制；探討在魚類抗病免疫反應中主效基因調(diào)控網(wǎng)絡、功能和抗病機理； 研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關的分子標記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設計育種的理論和技術方法，開拓其可行性途徑。 （二）、技術途徑： 1. 采用 solexa 深度測序等大規(guī)模測序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學分析，了解魚類生殖和生長不同階段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表達譜差異，經(jīng)生物信息學比較和分子特征分析，由此篩選調(diào)控魚類生殖、生長、抗性的主要基因和關鍵基因； 2. 建立重要魚類基因組 BAC 庫，研究 基因的結(jié)構(gòu)，克隆分離相應基因的啟動子；將其啟動子與 GFP 報告基因重組融合，利用基因轉(zhuǎn)移等技術，采用流式細胞儀等篩選分析技術，進一步研究生物學功