【正文】 在卵子成熟中的作用及調(diào)控機(jī)制研究； 魚(yú)類(lèi)卵 胚轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)制研究； 魚(yú)類(lèi)性別決定和性別分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能解析和作用機(jī)理研究； 魚(yú)類(lèi)性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記的鑒定及其分子設(shè)計(jì)育種可行性研究。項(xiàng)目的主要研究?jī)?nèi)容、課題設(shè)置的思路、各課題間的聯(lián)系和與項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題和總體目標(biāo)的關(guān)系如下圖所示。本項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容是在這些基礎(chǔ)上進(jìn)一步凝聚而來(lái)，目標(biāo)更為明確。 技術(shù)途徑的示意圖如下： 細(xì)胞示蹤等研究細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)方法、胚胎細(xì)胞移植等 體外孵育或灌流結(jié)合放射性免疫測(cè)定研究生理功能 DNA 甲基化分析 啟動(dòng)子分析 morpholino 介導(dǎo)、 siRNA 干擾等基因敲降方法 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除 模式魚(yú)類(lèi)（斑馬魚(yú)、青 鳉 、河豚、三棘刺魚(yú) 等 ）全基因組信息 前期 已獲得 的 大量與魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)和抗性相關(guān)基因資源 已建立 的大批魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系 魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)和抗性的主控 基因和分子標(biāo)記的功能揭示和作用機(jī)理闡明 比較轉(zhuǎn)錄基因組分析 Western、免疫組化、 WISH 等研究時(shí)空表達(dá)譜等方法 CoIP、 GSTpull down、 FRAP、 FRET、BiFC 等研究蛋白相互作用方法 ChIP、 EMSA 等研究核酸與蛋白相互作用等方法 FACS、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析、蛋白質(zhì)泛素化、乙?；刃揎椃治? 魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種數(shù)量性狀多基因聚合技術(shù) 魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù) 多基因信息整合 性狀的 QTL與 eQTL分析 基因同線性與性狀關(guān)聯(lián)性分析 蛋白分子設(shè)計(jì)、 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu) 的基因敲除方法、 BAC 或Tol2 轉(zhuǎn)座子、 Cre/lox、 PGC 操作、miRNA和 piRNAs 調(diào)控 魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)和抗性 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析 魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的策略和可行性途徑 （三）、創(chuàng)新點(diǎn)與特色： 1) 重要的研究對(duì)象，體現(xiàn)了國(guó)家重大需求導(dǎo)向： 本項(xiàng)目以我國(guó)重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)鯽、鯉等為主要研究對(duì)象，圍繞水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)創(chuàng)新所要解決的魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種 的策略和理論基礎(chǔ)以及魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題開(kāi)展研究，著眼于解決國(guó)家中長(zhǎng)期發(fā)展中所需要解決的重大科學(xué)問(wèn)題，體現(xiàn)了重大的國(guó)家需求導(dǎo)向。 （二）、技術(shù)途徑： 1. 采用 solexa 深度測(cè)序等大規(guī)模測(cè)序和基因芯片分析等手段，通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，了解魚(yú)類(lèi)生殖和生長(zhǎng)不同階段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表達(dá)譜差異，經(jīng)生物信息學(xué)比較和分子特征分析，由此篩選調(diào)控魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)、抗性的主要基因和關(guān)鍵基因； 2. 建立重要魚(yú)類(lèi)基因組 BAC 庫(kù)，研究 基因的結(jié)構(gòu)，克隆分離相應(yīng)基因的啟動(dòng)子；將其啟動(dòng)子與 GFP 報(bào)告基因重組融合，利用基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)，采用流式細(xì)胞儀等篩選分析技術(shù)，進(jìn)一步研究生物學(xué)功能； 3. 建立魚(yú)類(lèi) BAC 轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用雜交方法或 PCR 方法篩選重要功能基因的BAC 克隆，在基因編碼框的適當(dāng)位置插入綠色熒光蛋白（ EGFP）基因；利用以上構(gòu)件制備轉(zhuǎn)基因魚(yú)，通過(guò) EGFP 分析這些基因的時(shí)空表達(dá)情況及其生理學(xué)效應(yīng)； 4. 通過(guò)基因連鎖分析和原位雜交等技術(shù)，研究目的基因在染色體上的定位，揭示基因相互作用的基因組組織基礎(chǔ)； 5. 用 RTPCR、原位雜交和 Western blot 方法在 mRNA 及蛋白水平上檢測(cè)基因表達(dá)的組織特異性和時(shí)序性 。 二、預(yù)期目標(biāo) 本項(xiàng)目的總體目標(biāo)： 針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求，通過(guò)開(kāi)展重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)和抗性等主要經(jīng)濟(jì)性狀的功能基因組研究，解析魚(yú)類(lèi)生殖的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚(yú)類(lèi)抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選鑒定進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的主控或關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，在理論上闡明魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀和重要生命現(xiàn)象的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，提出魚(yú)類(lèi)良種分子設(shè)計(jì)的策略；在技術(shù)方法上，建立魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的多基因聚合和基因操作技術(shù)，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)育種材料，創(chuàng)建魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 3） 魚(yú)類(lèi)抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 利用我們自主建立的分離魚(yú)類(lèi)抗病毒基因的細(xì)胞模型，重點(diǎn)解析魚(yú)類(lèi)干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抗病作用機(jī)理；揭示重要魚(yú)類(lèi)病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機(jī)制；探討在魚(yú)類(lèi)抗病免疫反應(yīng)中主效基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能和抗病機(jī)理； 研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚(yú)類(lèi)抗病性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚(yú)類(lèi)抗病分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)方法，開(kāi)拓其可行性途徑。 2） 魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 采用 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降、整體原位雜交、細(xì)胞示蹤、免疫熒光定位以及組織碎片灌流和細(xì)胞孵育等在體和離體研究等技術(shù)，重點(diǎn)解析魚(yú)類(lèi)下丘腦/垂體控制生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚(yú)類(lèi)性成熟和生長(zhǎng)的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理；探討腦腸肽 /生長(zhǎng)激素 /類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路及其對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制；揭示卵泡抑素等 抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚(yú)類(lèi)肌肉細(xì)胞增殖和魚(yú)肉蛋白 /脂肪平衡的作用機(jī)理；研制可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系；闡明魚(yú)類(lèi)個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律；開(kāi)拓生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標(biāo)記尤其是主控基因用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 通過(guò)創(chuàng)制基于蛋白分子設(shè)計(jì)、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚(yú)類(lèi)基因快速敲除系統(tǒng)，創(chuàng)建基于破壞原生殖細(xì)胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系 等建立可用于魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)路線，并揭示性腺特異小 RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的作用，闡明 piRNA 與互作蛋白的調(diào)控途徑，研制出持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的轉(zhuǎn)基因魚(yú)，揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長(zhǎng)激素受體基因與轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因魚(yú)的效應(yīng)及其信號(hào)通路的調(diào)控差異。 三、研究方案 （一）、學(xué)術(shù)思路： 針對(duì) 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求， 以鯽和鯉等為主要研究對(duì)象，啟動(dòng)我國(guó) 重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究， 通過(guò)研究魚(yú)類(lèi)生殖、生長(zhǎng)和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，篩選鑒定進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù) 及其技術(shù)體系，解決魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，為魚(yú)類(lèi)分子設(shè)計(jì)育種的實(shí)踐和應(yīng)用以及為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)。將含有這些基因的真核表達(dá)載體，或在大腸桿菌中表達(dá)出的蛋白，注射到胚胎中或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 11. 將目的基因的反義 RNA或其蛋白的抗體注射到胚胎中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 12. 對(duì)生殖調(diào)控基因而言，設(shè)立人工性反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，分別提取不同性反轉(zhuǎn)階段實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表達(dá)的時(shí)序性； 13. 對(duì)生長(zhǎng)和生殖功能基因而言，合成重要調(diào)控生長(zhǎng)生殖基因的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或表達(dá)具有生物活性重組蛋白，取魚(yú)類(lèi)的下丘腦、垂體、肝臟和性腺，通過(guò)碎片灌流和細(xì)胞孵育等離體研究方法，或直接注射結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或重組蛋白，采用放射免疫測(cè)定等方法研究其活性，測(cè)定各種靶組織、血清中調(diào)控生殖生長(zhǎng)激素的含量，分析這些生長(zhǎng)調(diào)控因子和生殖調(diào)控因子的相互作 用及其信號(hào)傳遞機(jī)