【正文】 kosyl（十二烷基肌氨酸鈉） 3% 終濃度 ? 異硫氰酸胍 ? 非離子型去污劑 TritonX100、 Brij58 作用溫和、膜部 分破 2．解聚核蛋白并除蛋白 核酸 pI SDS結合蛋白質 濃 KAc + SDS → SDS K ↓ b．有機溶劑 酚、氯仿 蛋白質變性劑 酚、酚／氯仿－異戊醇、氯仿－異戊醇 注意：防剪切力（振蕩速度、大口吸管）， 處理酚（重蒸、緩沖液飽和、 % 8羥基喹啉） c． Proteinase K 處理 廣譜 ,水解力強 ,可在 SDS,EDTA存在下作用． 3．核酸的沉淀 a．乙醇 核酸的 Na, K 鹽在乙醇中 ↓ ? 調節(jié)鹽濃度： NaCl, NaAc, NH4Ac ? 加 冷乙醇（ ﹥ 95%） 攪出 DNA 或離心 ↓ ? 7075% 乙醇洗滌去鹽 除盡 EtOH,干燥 ? 溶于 TE (10mM TrisHCl pH ,1m MEDTA) ? 核酸濃度 ﹤ , 加助沉淀劑 ? 重復沉淀， 補鹽 ! b．異丙醇 M NaAc, 選擇性沉淀 DNA and 大 RNA, 體積小，不需 低溫放置． 沸點高，鹽 ↓ ，須 EtOH 洗滌． 4. 雜質的去除 a. 小分子雜質 b. 多糖 ? 樣品預處理 動物 饑餓 植物 暗化 ? 選擇性沉淀 ? 異丙醇 糖與小分子 RNA不 ↓ ? CTAB（十六烷基三甲基溴化銨） CH3 | CH3(CH3)15–N+–CH3 + NA– / \ CH3 CH3 CTANA ? NaNA ? (EtOH) + CTAAc（溶） Br NaAc 70% EtOH 1% NaCl 多糖溶解 c. RNA與 DNA 互為雜質 DNP 溶于 12M NaCl RNP 溶于 NaCl ? 除 RNA RNase( 100℃,15min 處理 ,除 DNase) ? 除 DNA RNasefree DNase 5. 保存 防止降解、變性 措施：滅菌、低溫、鹽濃度、 pH、 EDTA…… DNA TE buffer,4 –20℃, 70 % EtOH RNA 冰凍干燥、低溫 6. 純度的初步鑒定 a. UV吸收曲線 b. UV吸收比值 DNA A260/A280 = RNA A260/A280 = 核酸的含量測定 (260nm,1cm 光徑 ) 1 A260 50μg/ml dsDNA 40μg/ml ssDNA, RNA 36μg/ml oligo Nts c. 膠電泳 定量 , 定性 四 . 核酸的純化 ? 沉降速度法 被分離物質在強大的離心力場中因 沉降速度 不同而分離 . (速度區(qū)帶超離心 ). ? 沉降平衡法 被分離物質在離心時因 浮密度 不同進行分離 .(浮密度梯度 or 等密度梯度超離心 ). ? 浮密度 ρ 是溶劑化密度 ,即核酸銫鹽水化物 ( CsCl,H2O,NA )的密度 . ? 不同介質下 ,核酸的 ρ 不同 . CsCl ρ DNA= 。 20種 3’ Nt, 22種 5’ Nt, 40種 Ns, 14種抗水 解 NmNp dimer. AmGp ~GmAp CmUp ~ UmCp 2. 鑒定 a. 標準品對照 (電泳 ,層析 ) UV吸收檢出 吸收 UV藍紫色斑點 , G藍色熒光 , D無吸收。 下一代配子保持相同格式 Igf2 gene IGFⅡ 胰島素 like生長 因子依賴于父本表達 Igf2R gene IGFⅡR 胰島素 like生長 因子受體依賴于母本表達 一條 X染色體的失活 ? 甲基化格式的建立、維持和改變 從無到有 (de novo)甲基化 雙鏈相對 CpG mCpG 確立新格式 甲基化的維持 脫甲基 被動 復制后不再甲基化 主動 甲基轉移 堿基切除修復 ? CpGrich islands 基因組中存在異常非甲基化 CpG順序簇 高含量 C+G 高頻率 CG dimer (10/100bp ) 分布不均 , 長 12 kb， 間隔 ~100 kb 非甲基化 –CpG 存在 ： housekeeping genes tissues specific genes 5’ 啟動子 ——轉錄區(qū) 腺嘌呤磷酸核糖 轉移酶 CpG密度 1/100bp CpG密度 10/100bp –100 ~ 300 1. 二氫葉酸還原酶基因 2. 次黃嘌呤轉磷酸核糖酶基因 3. 核糖體蛋白質基因 1 2 3 CG mCG 抑制轉錄的蛋白質 MeCP1 *CpG 成簇 MeCP2 *CpG DNA甲基化有助于基因關閉 五 . 核酸及其化學組分的化學反應 磷酸二酯鍵 , 磷酸單酯鍵 , N糖苷鍵 a. 酶水解 b. 酸堿水解 ? 磷酸二酯鍵 ? 酸 熱強酸 dA,dG 30mi （ 100176。2poly U 按 1:2結合成復合物 (三鏈 ) 抗生素 第二信使 嘌呤霉素 細胞激動素 能源庫 輔酶 二 . 糖環(huán)的折疊形式 構型 (configuration)共價化合物中 ,各個原子在空間的相對排列關系。 構型的改變涉及到共價鍵破壞