20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細(xì)胞術(shù)樣品制備(完整)(存儲(chǔ)版)
【正文】 ⑥以300目尼龍網(wǎng)過濾除去細(xì)胞團(tuán)塊。,第十二頁，共三十一頁。,第十三頁，共三十一頁。,實(shí)驗(yàn)步驟： ①將組織切成薄片(b225。,實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用化學(xué)試劑處理組織導(dǎo)致細(xì)胞成活率降低，細(xì)胞產(chǎn)額較低，細(xì)胞碎片(su236。)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用最佳的細(xì)胞固定方法，以免由于固定劑的原因，造成FCM檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定。 ④水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度(tī d249。 ⑨制備好的單細(xì)胞懸液作涂片，AO染色在熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)為完整細(xì)胞核，核發(fā)出黃綠色熒光。)介紹幾種血細(xì)胞的分離制備方法。,第二十二頁，共三十一頁。 2.1640培養(yǎng)液10.0ml,放入培養(yǎng)瓶內(nèi),將稀釋血加入 培養(yǎng)液中,混勻,與培養(yǎng)瓶接觸面要大。 7.將細(xì)胞以70%乙醇固定,置04℃冰箱保存?zhèn)錂z。xīn)沉淀,再用生理鹽水洗滌2次,離心(l237。ngzh236。 3.70%冷乙醇固定，置于冰箱備檢。)Hank180。,。④收集細(xì)胞懸液，離心沉淀1000prm，5分鐘。xīn)沉淀2分鐘，棄上清。 2.留取沉淀液1020ml，吸入試管內(nèi)，以生理鹽水洗三次，以1500prm離心沉淀5分鐘。,第二十七頁，共三十一頁。 5.脫落下來的細(xì)胞移入離心管,離心沉淀1500prm,5分鐘,再以生理鹽水漂洗2－3 次,每次離心800prm,2分鐘,以去除碎片雜質(zhì)。,第二十三頁，共三十一頁。 ⒋用吸管將上層與中層之間的淋巴細(xì)胞吸出，收集到另一支離心管，用生理鹽水稀釋至10ml，離心洗滌2次，每次均以1500prm, 10分鐘，棄上清后即得到純度較高的淋巴細(xì)胞，但可有少量的單核細(xì)胞。,第二十頁，共三十一頁。 ⑦經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，未消化完的組織片可以二次消化。 ②將切取的組織片放入試管中。,注意事項(xiàng)： Ⅰ新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時(shí)進(jìn)行保存，以免組織在室溫下放置時(shí)間過長，造成細(xì)胞自溶導(dǎo)致DNA降解，影響FCM測(cè)定結(jié)果。 ⑤70%乙醇固定置冰箱中被檢。 各取40ml混合，分裝置冰箱保存，用時(shí)過濾既可。xīn)沉淀500800prm，12分鐘，再用生理鹽水洗三次，離心(l237。 ③用300目的尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液除去大的團(tuán)塊 ④收集細(xì)胞懸液，離心沉淀1000prm，5分鐘。 ④用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管中。,第九頁，共三十一頁。應(yīng)指出，用于組織分散的很多酶是不夠純的，不僅含有一種占主導(dǎo)的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物質(zhì)，它們的活性可能有利于組織分散，也可能對(duì)組織的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生不利的影響。 ﹡二是可以水解組織細(xì)胞的緊密連結(jié)裝置的蛋白性物質(zhì)(w249。 如果不是及時(shí)上機(jī)檢測(cè)，則需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，常規(guī)固定液為70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。bāo)分散為單個(gè)細(xì)胞(x236。流式細(xì)胞術(shù)的樣品(y224。,一、單層培養(yǎng)細(xì)胞(x236。i) 操作步驟： 離心去除舊培養(yǎng)液，PBS液洗滌細(xì)胞一次，離心去掉上清液，約留0.5ml細(xì)胞懸液，用振蕩器使細(xì)胞分散。,⒈酶消化法 酶對(duì)實(shí)體組織分散作用原理主要有三方面： ﹡一是可以破壞組織間的膠原。ng)的限制性，特別是在進(jìn)行免疫標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，酶處理可能改變細(xì)胞膜的成分，從而影響細(xì)胞亞群的區(qū)分。
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