20xx年醫(yī)學(xué)專(zhuān)題—流式細(xì)胞術(shù)樣品制備(完整)-文庫(kù)吧
2025-11-01 05:41 本頁(yè)面
【正文】 實(shí)驗(yàn)時(shí)，酶處理可能改變細(xì)胞膜的成分，從而影響細(xì)胞亞群的區(qū)分。應(yīng)指出，用于組織分散的很多酶是不夠純的，不僅含有一種占主導(dǎo)的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物質(zhì)，它們的活性可能有利于組織分散，也可能對(duì)組織的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生不利的影響。,第八頁(yè)，共三十一頁(yè)。,酶學(xué)方法的一般程序： ①將適合于酶消化的組織(zǔzhī)置于離心管中。 ②將選好的酶溶液12ml加入盛有被消化組織的試管中。 ③一般消化2030分鐘(恒溫37186。C或室溫)，消化期間要間接振蕩或吹打。 ④終止消化，收集細(xì)胞懸液，以尼龍網(wǎng)(200目)過(guò)濾，除去大團(tuán)塊，以低速離心除去細(xì)胞碎片。 ⑤將制備好的單細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析或保存。,第九頁(yè)，共三十一頁(yè)。,⒉機(jī)械法 機(jī)械法分裂實(shí)體組織包括：用剪刀剪碎或用鋒利的解剖刀剁碎，用勻漿器勻漿，用細(xì)注射針頭抽吸細(xì)胞以分散細(xì)胞，采用網(wǎng)搓法同樣也能獲得大量的細(xì)胞，機(jī)械法易造成細(xì)胞懸液中細(xì)胞碎片，所以機(jī)械法常與其他方法配合(p232。ih233。)使用。,第十頁(yè)，共三十一頁(yè)。,常用的幾種機(jī)械法制備過(guò)程如下： ?剪碎法： ①將組織塊放入平皿中，加入少量的鹽水。 ②用剪刀將組織剪至勻漿狀。 ③加入10ml生理鹽水。 ④用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾到試管中。 ⑤離心沉淀1000prm35分鐘，再用生理鹽水洗三次，每次以短時(shí)低速離心沉淀(500800prm)去除細(xì)胞碎片。 ⑥以300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾除去細(xì)胞團(tuán)塊。 ⑦70%冰乙醇(yǐ chn)固定，放入4℃冰箱。,第十一頁(yè)，共三十一頁(yè)。,?網(wǎng)搓法： ①將100目銅網(wǎng)扎在小燒杯(shāobēi)上。 ②把剪碎的組織放在網(wǎng)上，以眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直到將組織搓完。 ③用300目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液除去大的團(tuán)塊 ④收集細(xì)胞懸液，離心沉淀1000prm，5分鐘。 ⑤70%乙醇固定，置4℃冰箱備用。,第十二頁(yè)，共三十一頁(yè)。,?研磨法 準(zhǔn)備一只70ml組織研磨器 ①將組織剪碎至小塊。 ②放入組織研磨器中，加入12ml生理鹽水。 ③轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研至勻漿即可。 ④加入生理鹽水1020ml，沖洗研器。 ⑤收集細(xì)胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，離心(l237。xīn)沉淀500800prm，12分鐘，再用生理鹽水洗三次，離心(l237。xīn)沉淀。,第十三頁(yè)，共三十一頁(yè)。,⒊化學(xué)試劑處理法 化學(xué)試劑處理法的主要(zhǔy224。o)原理是將細(xì)胞間起粘連作用 的鈣鎂離子置換出來(lái)，從而使細(xì)胞分散下來(lái)。 試劑配制： ①0.2%EDTA配制 EDTA0.2g溶解后，加入Hank180。s液100ml，封裝高壓消毒，置04℃保存。 ②胰酶加EDTA配制 胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml，濃度0.125%，EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml，濃度0.2%。 各取40ml混合，分裝置冰箱保存，用時(shí)過(guò)濾既可。,第十四頁(yè)，共三十一頁(yè)。,實(shí)驗(yàn)步驟： ①將組織切成薄片(b225。o pi224。n)放入試管。 ②加入EDTA液5ml，室溫，半小時(shí)，棄之。 ③加入胰酶+EDTA液510ml，在37℃恒溫水浴30分鐘，間
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