【正文】 A）（ %100(%)100 ?????????? XINSSSSXINSS At o te）（）（%100)(1 1212???????? ???????? ??XINXXnXXIiIiinjij第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 例 2 用 ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）法檢測(cè) veroE6，細(xì)胞培養(yǎng)上清正常標(biāo)本 10份的結(jié)果（ 100 OD490值）為2， 3， 3， 4， 4， 5， 5， 5， 6， 8，求標(biāo)準(zhǔn)差。是限度試驗(yàn)參數(shù)，無(wú)需定量測(cè)定。 常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（ S/N）為 10∶ 1時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定，也可用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（ SD）的 10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定。 數(shù)據(jù)要求： 應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖。 目的 為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù) . 體現(xiàn)耐用性因素： ? 被測(cè)溶液的穩(wěn)定性 ? 樣品提取次數(shù) ? 時(shí)間 ? 試劑來(lái)源 耐 用 性 指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí) ,分析相同樣品所測(cè)得的試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)程度 . 2. 雜質(zhì)的限量檢查除專屬性、檢測(cè)限、耐用性外，其它都不要求。 線性： 吸光度 A一般在 ～ ，濃度點(diǎn) n＝ 5。 批間精密度：是不同次測(cè)定的精密度 。 批內(nèi)精密度：是同一次測(cè)定的精密度 。 2. UV法 ： 用適當(dāng)濃度的精制品進(jìn)行測(cè)定，其RSD一般不大于 1％ 。 （八） 耐用性 (robusness) 指測(cè)定條件稍有變動(dòng)時(shí)，結(jié)果不受影響的承受程度，為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。 生物藥物分析 中考慮 :內(nèi)源性物質(zhì)干擾 ,代謝產(chǎn)物的干擾 ,同時(shí)服藥時(shí)的干擾 。 （四）定量限 （ 1imit of quantitation，LOQ） 指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度。 精密度高 準(zhǔn)確度較差， 即系統(tǒng)誤差較大； 甲 乙 丙 準(zhǔn)確度高， 但精密度較差， 即偶然誤差較大； 精密度比較好 準(zhǔn)確度比較好， 稱為精確度高， 偶然誤差比較小 系統(tǒng)誤差比較小 用打靶時(shí)彈著點(diǎn)為例，說(shuō)明上述二個(gè)詞的意義。 例 1：計(jì)算下面這一組測(cè)量值的平均值（ ），平均偏差（ d平均 ），相對(duì)偏差（ d平均 ﹪ ） , , , , 解： 平均值 =∑ xi/n 平均偏差 =∑ ︱ di︱ /n=∑ ︱ xi ︱ /n =(++++)/5 = =(++++)/5= 平均相對(duì)偏差 = ∑ ︱ di︱ /n 100% = 100% = ﹪ 表示方法 精密度一般用 標(biāo)準(zhǔn)偏差 (standard deviation， SD或Ｓ )或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (relative standard deviation， RSD)表示 若設(shè)供試品的測(cè)定值為 Xi， 則其平均值為 ， 且有 n個(gè)測(cè)定值 ， SD= ? ?112?????nXXniii RSD= = ）（ %100?XSD? ?）（ %100112??????XnXXniii?——包括 批內(nèi) (withinrun或 intraassay)RSD— 日內(nèi) (withinday) ?和 批間 (betweenrun或 interassay)RSD— 日間(between day， daytoday) ? ?112?????nXXniii標(biāo)準(zhǔn)偏差 是反映一組供試品測(cè)定值的離散的統(tǒng)計(jì)指標(biāo) 。 變動(dòng)因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備 精密度 (3) 重復(fù)性 (repeatability) 重復(fù)性指采用相同方法，在同一實(shí)驗(yàn)室用同一試驗(yàn)物質(zhì)，同一操作者使用同一設(shè)備，在短時(shí)間間隔內(nèi)，在相互獨(dú)立試驗(yàn)中所獲得結(jié)果的一致性。 —— 系指每次測(cè)定結(jié)果與多次測(cè)定的平均值的 偏離程度 用 偏差（ d） 、 標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD)、 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)（變異系數(shù)， CV） 表示。 1. 含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度 原料藥 可用已知純度的對(duì)照品或樣品進(jìn)行測(cè)定，或用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證 一、目的 證明所采用的分析方法適合于相應(yīng)的檢測(cè)要求，方法驗(yàn)證過(guò)程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草和修訂說(shuō)明中。 目的及前提 多元 消解法 硝酸 硫酸 五氧化二礬消解法 硝酸 氫氟酸 高氯酸消解法 硝酸 硫酸 高錳酸鉀消解法 鹽酸 硝酸 氫氟酸 高氯酸消解法 硝酸 硫酸 高氯酸消解法 注意事項(xiàng)： ，一般為硅玻璃或硼玻璃制成的 凱氏燒瓶 ； 離子或干擾測(cè)定的其他金屬離子等組分； 品，所以必須按相同條件進(jìn)行 空白試驗(yàn)校正 ； 。 ? 防止硫酸在加熱過(guò)程中過(guò)早地分解為三氧化硫而損失。故進(jìn)行破壞時(shí)，必須嚴(yán)密注意切勿將容器中的內(nèi)容物蒸干，以免發(fā)生爆炸。 一般包括 濕法破壞 、 干法破壞 及氧瓶燃燒法 三種方法。 氧化性 測(cè)定含量 例如含銻和含鐵的藥物，在酸性溶液中可游離出具有氧化性的 Sb5+ 、Fe3+氧化碘化鉀析出碘，用硫代硫酸鈉滴定。每 1ml硫氰酸銨滴定液 ()相當(dāng)于 。干法破壞；氧瓶燃燒 （一）不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 1. 直接測(cè)定法 適用于金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬有機(jī)藥物或某些 C—M鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物。 9H2O葡萄糖酸銻鈉 抗寄生蟲藥 ，治療黑熱病 B. 有機(jī) 金屬 藥物 金屬原子直接與碳原子以共價(jià)鍵相連，結(jié)合比較牢固。 ① 根據(jù)被燃燒分解的樣品量選用適宜大小的燃燒瓶 。 C O O H I N H C O C H 3 I I H 3 C O C H N + 11NaOH + Zn 回流 △ C O O Na N H2 H2 N + 3NaI + 2CH3COONa + 2Na2ZnO2 + H2O USP (24)、 BP（ 1998） ChP(2023)收載的膽影酸 、 碘番酸 、 膽影葡胺 、 泛影葡胺 、 碘他拉酸等均采用同法測(cè)定 。 例：三氯叔丁醇的測(cè)定 ChP （ 2023） CCl3?C(CH3)2?OH + 4NaOH △ 回流 (CH3)2?CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2O NaCl + AgNO3 AgCl↓ + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN ↓ + NH4NO3 （淡棕紅色） (Ksp= 10–10 ) (Ksp= 10?12 ) Fe3+ + SCNˉ Fe (SCN) 2+ 測(cè)定方法 取本品約 ， 精密稱定 ， 加乙醇 5ml溶解后 ， 加 20%氫氧化鈉溶液 5ml，加熱回流 15min， 放冷至室溫 ， 加水 20ml與 硝 酸 5 ml， 精 密 加 硝 酸 銀 滴 定 液() 30ml， 再加 鄰苯二甲酸二丁酯5ml， 密塞 ， 強(qiáng)力振搖后 ， 加硫酸鐵銨指示液 2ml， 用硫氰酸銨滴定液 ()滴定 ， 并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正 。 定量分析樣品的前處理方法 概述 含 金屬或鹵素 的藥物，在分析前需要經(jīng)過(guò)不同方法處理后，方可進(jìn)行測(cè)定。 反應(yīng)摩爾比為 1∶ 3 3?????ncMTT—— 滴定度 ， 每 1ml滴定液相當(dāng)于被測(cè)組分的 mg數(shù) c—— 滴定液濃度 ， mol/L M—— 被測(cè)物的摩爾質(zhì)量 ， g/mol n—— 1mol樣品消耗滴定液的摩爾數(shù) ， 常用反應(yīng)摩爾比體現(xiàn) ， 即反應(yīng)摩爾比為1∶ n (1)堿性還原后測(cè)定 鹵素結(jié)合于芳環(huán)上時(shí)，由于分子中碘的結(jié)合較牢固，需在堿性溶液中加還原劑（如鋅粉）回流，使碳 碘鍵斷裂，形成無(wú)機(jī)碘化物后測(cè)定。每 1ml硝酸銀滴定液 ()相當(dāng)于 C11H12 I 3NO2。每 1mL硝酸銀滴定液 ()相當(dāng)于 (Br)。 如 卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利 N H C O N H2A sOO HH O卡巴胂 用于陰道滴蟲病及絲蟲病 H g O C O C H3醋酸苯汞 外用避孕藥 O C H2C O O N aC O N H C H2C H C H2H g O HO C H3汞撒利 利尿及脫水藥，用于心臟性和肝性水腫 含金屬有機(jī)藥物定量分析前的處理方法 ? 不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 直接測(cè)定法 。每 1ml硫酸鈰滴定液 ()相當(dāng)于 。 如 醋酸苯汞的含量測(cè)定 取本品約 ， 精密稱定 ， 置 100ml燒瓶中 ，加水 15ml， 甲酸 5ml與鋅粉 1g， 附回流冷凝器