【正文】 (60mg,3ml Waters)，C18(500mg,3ml,)和LiChrolut EN(200mg,3ml,Merck)四種固相萃取柱的凈化效果和回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LiChrolut EN柱凈化效果和回收率比另外三種固相萃取柱都較理想。SEM:。測試樣品按以下順序進(jìn)樣：試劑空白、陰性控制樣（樣品空第二章 實驗方法 6 白）、要確證的樣品、陰性控制樣品（樣品空白）再進(jìn)樣，最后是陽性控制樣品（質(zhì)控樣品或添加回收樣品）。而后用1mol/LNaOH或HCl調(diào)pH 至~，15℃4500r/min離心 15min，用125mm濾紙過濾上清液。L 至50mL 容量瓶，甲醇定容，混勻混合內(nèi)標(biāo)工作液（100ng/mL） 準(zhǔn)確移取混合內(nèi)標(biāo)中間液 100181。水解產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用 %甲酸溶液溶解，較渾濁的樣品，如樣品蝦，可經(jīng)過乙酸乙酯提取，然后再經(jīng) SPE 凈化。因此加快動物源性食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物檢測方法的研究勢在必行。分光光度法雖然操作簡單，但測定結(jié)果準(zhǔn)確度不高，靈敏度低，不能作為確證性方法。通過分析20個樣品，使用陰性蝦樣品添，%%。不同的添加水平，得到相應(yīng)的平均回收率和變異系數(shù)RSD；④交叉反應(yīng)。其原理是：將被測樣本中的結(jié)合代謝殘留物經(jīng)水解、衍生形成NPAOZ，其與過氧化物酶標(biāo)記的NPAOZ競爭結(jié)合有限的NPAOZ抗體(競爭性酶免疫分析)，同時此抗體又與包被在微孔板條上針對它的抗體結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的NPAOZ后，加入酶反應(yīng)底物和生色劑到孔中并且孵育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。 免疫分析法（IA）國內(nèi)外關(guān)于硝基呋喃類抗生素的免疫分析方法的報道很少。余建新等 [26]采用微量化樣品前處理技術(shù)，以鄰硝基苯甲醛為衍生劑，電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測方式建立了蜂蜜及水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類抗生素代謝物殘留量同時測定的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)方法。Alexander Leitner等 [23]提出用LCMS/MS方法同時分析動物肌肉組織中四種硝基呋喃類抗生素的代謝物的方法。目前，HPLC、LCMS 相關(guān)聯(lián)的NPAOZ 提取方法已經(jīng)得到改良，并通過一系列的加標(biāo)樣品研究得以驗證。HorneE 等進(jìn)一步對該方法進(jìn)行改進(jìn)，利用 SPE簡化了衍生后的呋喃唑酮代謝物NPAOZ的提取過程，再用LCMS 法進(jìn)行定性分析，對檢測豬肝中呋喃唑酮代謝物AOZ的不同方法進(jìn)行比較研究，表明利用HPLC法和LCMS法測定 AOZ的結(jié)果基本相同 [20]。 聯(lián)用技術(shù)分析法（1）液相色譜質(zhì)譜法(LCMS)色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于多組分混合物的分離和分析，特別適合有機化合物的定量分析，但定性較困難；質(zhì)譜儀只能夠?qū)我唤M分提供高靈敏度和特征的質(zhì)譜圖，但對復(fù)雜化合物分析無能為力。9)% 、(87177。Owen [15]利用LCECD( 工作電極為玻碳電極，工作 ，參比電極為Ag/AgCl電極)檢測用含有呋喃唑酮的飼料喂養(yǎng)的雞的肝臟和胸部肌肉組織中的呋喃唑酮的殘留。Angelini [12]利用LCUV 方法檢測牛肌肉組織中四種硝基呋喃類藥物的殘留，方法的檢測限是1mg/kg，定量限是2mg/kg，平均回收率76%。然而由于硝基呋喃類抗生素對光敏感，具有代謝快速的特點，在動物體內(nèi)的半衰期不過數(shù)小時，通常不太可能檢出原藥的殘留，例如呋喃唑酮在停藥后12h內(nèi)從組織中消失，而其代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)在動物體內(nèi)則以組織蛋白結(jié)合物的形式存在，在體內(nèi)可殘留數(shù)周，在停藥后至少6周內(nèi)AOZ在豬肌肉組織中繼續(xù)存在 [10]，因此當(dāng)原藥濃度降至檢測限以下時，檢測其代謝物濃度是可能的。其他可供選擇的柱還有如 Waters Oasis HLB SPE、Varian Bond Elut ENV/LMS、Supelco Supelclean EnviChrom P、JT Baker Bakernond H2Ophobic DVB、 IST Isolute101 等。 基體固相分散技術(shù) （MSPD）基體固相分散技術(shù)是將硅藻土或非極性的 C18 衍生硅膠等作為吸附劑，加第一章 引 言 6 入到樣品中，混合均勻，或者樣品與吸附劑一同研磨，然后把攪拌均勻的物質(zhì)填充到層析柱中，用溶劑淋洗，達(dá)到凈化的目的，該技術(shù)可以克服液液萃取過程中產(chǎn)生乳化的問題。 樣品的凈化通常，得到的水提取液或有機提取液中，目標(biāo)分析物濃度較低，還含有許多共萃取基質(zhì)，如果這些物質(zhì)在最終的溶液中存在，不僅會干擾檢測，也會增加背景噪聲，無法測定痕量濃度的目標(biāo)分析物。通常水解選用稀鹽酸，濃度為 。對于蝦類樣品的處理，先粉碎均勻，再冷凍儲存，但對其他肌肉組織、腎臟和肝臟等樣品，需要先冷第一章 引 言 4 凍，后選擇有代表性部分切成薄片，再進(jìn)一步粉碎。飼料生產(chǎn)企業(yè)要加強對生產(chǎn)原料的管理，做到原料來源清楚，記錄明確；要加強對原料檢測，重點加強對魚粉原料的檢測；要防止含有硝基呋喃類藥物的飼料原料投入生產(chǎn)，防止在生產(chǎn)過程中污染違禁藥物。2022 年開始，我國將硝基呋喃納入殘留監(jiān)控計劃中。歐盟(EU)N0807/2022 法規(guī)中，規(guī)定使用 HPLC 方法檢測呋喃唑酮，檢測限量 2ng/kg~4ng/kg。用呋喃唑酮對種雞進(jìn)行處理以后，代謝物殘留將按種雞種蛋 雛雞成雞的生物鏈條傳遞。在硝基呋喃類藥物中，以呋喃西林對家禽的毒性作用最常見，尤其是雛鴨和雛雞，以220mg/kg混飼喂雛鴨或以400mg/kg混飼喂雛雞，連續(xù)用藥10天以上，出現(xiàn)呆滯、羽毛蓬松、厭食或興奮、驚厥癥狀，最后死亡。呋喃類藥物內(nèi)服后，吸收較少，吸收的部分在體內(nèi)迅速被破壞，血藥濃度低，不易達(dá)到有效濃度，不宜用于全身感染的治療。圖11 四種硝基呋喃代謝物結(jié)構(gòu)式第一章 引 言 1 這類抗生素因其具有抑菌性和殺菌性而廣泛用于家禽、家畜、水產(chǎn)、蜂等動物傳染病的預(yù)防與治療，部分品種具有促生長的作用，可用作飼料添加劑。大劑量或長時間應(yīng)用硝基呋喃類藥物均能對畜禽產(chǎn)生毒性作用，其中呋喃西林的毒性最大，呋喃唑酮的毒性最小，為呋喃西林的1/10左右。硝基呋喃類藥物在體內(nèi)代謝迅速，代謝第一章 引 言 2 的部分化合物分子與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合成為結(jié)合態(tài)，結(jié)合態(tài)可長期保持穩(wěn)定，從而延緩藥物在體內(nèi)的消除速度。由于對呋喃唑酮蛋白結(jié)合態(tài)殘留物的安全性產(chǎn)生懷疑，自 1995 年起歐盟全面規(guī)定禁止使用呋喃類抗菌物質(zhì)，在動物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。我國目前使用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) SN0530－1996 出口肉品中呋喃唑酮殘留量檢驗方法:液相色譜法，檢測限量 [45]。加強對飼料生產(chǎn)企業(yè)的監(jiān)控，嚴(yán)禁使用農(nóng)業(yè)部規(guī)定以外的獸藥作為飼料添加劑。 樣品的均質(zhì) 取樣時，通常僅取可食部分，并注意具有代表性。 水解和衍生化對于硝基呋喃代謝物的測定，鑒于其殘留物主要以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在，只有在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下經(jīng)水解過程，才能釋放出游離代謝產(chǎn)物，而且因殘留物的濃度一般非常低，需要采用衍生化手段提高靈敏度，故樣品的處理需要水解和衍生化。值得注意的是，許多細(xì)胞大分子也含有可反應(yīng)的氨基，需加入遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的2NBA 來確保由蛋白結(jié)合殘留釋放出的自由代謝產(chǎn)物全部衍生化。液液萃取的優(yōu)點是成本低，不需要特殊的實驗設(shè)備，其缺點是在萃取過程中有時產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，且有機溶劑消耗量大。LiChrolut EN 和 SDBL 柱可以提供相似的結(jié)果，但保留特性有少許差別。 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的檢測方法在國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表有關(guān)硝基呋喃類抗生素的殘留檢測方法的文獻(xiàn)中，早期的文獻(xiàn)報道大多數(shù)是檢測原藥化合物。經(jīng)衍生化試劑衍生化后，產(chǎn)生強紫外吸收，第一章 引 言 8 其檢測限可以達(dá)到1μg/kg，但是復(fù)雜的基質(zhì)會導(dǎo)致測定困難和干擾。（2）液相色譜電化學(xué)檢測器(LCECD)電化學(xué)檢測器(ECD) 因其高靈敏性也在硝基呋喃類抗生素的檢測中得到應(yīng)用。11)%~(97177。呋喃唑酮的檢測限為1ng/g，鹽酸呋喃它酮的檢測限為2ng/g。荷蘭瓦郝尼罕RIKIL TDLO實驗室建立了完整的LCMS 法檢測呋喃唑酮代謝物AOZ 及其他代謝物 [19]。用此方法在北愛爾蘭豬呋喃唑酮殘留事件中對100個豬腎臟樣品進(jìn)行了測定，7份濃度在1~5ng/g之間，4份小于1ng/g ，還有1份達(dá)到144ng/g。目前許多國家已將LCMS/MS方法作為檢測硝基呋喃類抗生素的代謝物的確證性方法。~10ng/g范圍內(nèi)，AMOZ回收%~%，%~%，AH回收率為%~%，%~%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)%。分光光度第一章 引 言 12 法可以判定動物性產(chǎn)品中是否存在硝基呋喃類藥物，且該法不需昂貴的儀器與試劑，也沒有復(fù)雜的樣品前處理，操作簡單，對于硬件設(shè)備不夠完善的質(zhì)檢部門和生產(chǎn)企業(yè)有較好的推廣及應(yīng)用價值，但測定結(jié)果準(zhǔn)確度不高，最低檢測限較高，靈敏度低，不能作為確證性方法。各種硝基呋喃類物質(zhì)代謝物中以AOZ較為典型，以此為例。測定了不同批次(n=5)測試時添加實驗的變異系數(shù)。隨后， [30]又建立了蝦組織中呋喃唑酮組織結(jié)合代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)的酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)。ELISA方法具有快速、簡便、靈敏、方法種類多、高特異性等優(yōu)點，缺點是容易出現(xiàn)假陽性問題。附加證明的主要內(nèi)容是：該產(chǎn)品出口前經(jīng)過獸藥殘留特別是氯霉素和硝基呋喃代謝物的檢測，檢測結(jié)果要符合以下要求:氯霉素；呋喃唑酮(AOZ)；呋喃它酮(AMOZ)；呋喃妥因(AH)；呋喃西林 (SC)。第一章 引 言 16 第二章 實驗方法 0 第 二 章 實 驗 方 法 原理組織樣品經(jīng)均質(zhì)后經(jīng) HCl 水解，采用 2硝基苯甲醛進(jìn)行衍生化。L 于 10mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，混勻內(nèi)標(biāo)儲備液（1mg/mL）分別精確稱取 ，SCA13C15N2，AOZD 4，AHD 13C3 至 50mL 容量瓶中，用甲醇在超聲波水浴中溶解，然后甲醇定容到刻度，混合均勻混合內(nèi)標(biāo)中間液（10μg/mL）移取 AMOZD5，SCA 13C15N2，AOZD4，AHD 13C3 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液各 500181。勻漿液在37℃水浴中振蕩16h（過夜），頻率為 60Hz。樣品溶液中目標(biāo)化合物響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測定線性范圍內(nèi)。第三章 結(jié)果計算及討論 1 圖31 硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖(AMOZ:。這種方法有時出現(xiàn)乙酸乙酯和水相分層不徹底的情況，易產(chǎn)生干擾，從而影響回收率。采用MRM模式，按三離子原則對分析物進(jìn)行定性，推測斷裂方式如圖33，選用離子335291，340296；209166，212168；249134 ，252134；236134，240134定量。第三章 結(jié)果計算及討論 3 表 32 硝基呋喃代謝物的定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量和去簇電壓名稱 定性離子對 /（m/z） 定量離子對 /（m/z ） 碰撞氣能量 /eV 去簇電壓/VSEM AHD181732606060AOZ AMOZ SCA13C15N2 AHD13C3 AOZD4 AMOZD5 圖33 第三章 結(jié)果計算及討論 4 圖34 圖35 第三章 結(jié)果計算及討論 5 圖36 檢測限、測定低限、回收率和精密度 回收率統(tǒng)計硝基呋喃類代謝物的回收率如下：第三章 結(jié)果計算及討論 6 表 33 呋喃妥因回收率方法名稱動物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定化合物名稱 AHD回收率％添加水平(μg/㎏) 1 2 3 4 5 6平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù)％第一組 第二組 第三組 第一組 第二組 第三組 第一組 第二組 第三組 第三章 結(jié)果計算及討論 7 表 34 呋喃它酮回收率方法名稱動物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定化合物名稱AMOZ回收率％添加水平(μg/㎏) 1 2 3 4 5 6平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù)％第一組 第二組 第三組 第一組 第二組 第三組 第一組 第二組 第三組 第三章 結(jié)果計算及討論 8 表 35 呋喃唑酮回收率方法名稱動物源食品中硝基呋喃代謝物殘留量的測定化合物名稱 AOZ回收率％添加水平(μg/㎏) 1 2 3 4 5 6平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差變異系數(shù)％第一組 第二組 第三組 第一組 第二組 第三組 第一組 第二組 第三組 第三章 結(jié)果計算及討論 9