【正文】 本方法用兔肉、雞肝、魚(yú)、腸衣、蝦、魚(yú)糜等空白基質(zhì)進(jìn)行室內(nèi)精密度試驗(yàn)，添加水平為 、其總體相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD ）分別為AMOZ：％~ ％； SEM：％~％；AHD：％~％；AOZ：％~％。另外，禽肉中硝基呋喃的代謝物以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在于機(jī)體組織中，只有在適當(dāng)酸性條件下，通過(guò)水解才能釋放出來(lái)。g/㎏；X ——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度， ng/mL；C Csi ——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，ng/mL ；Ci ——樣液中 內(nèi)標(biāo)物的濃度， ng/mL；As ——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積；A ——樣液中待測(cè)目標(biāo)物的峰面積；Asi ——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ai ——樣液中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；V ——樣品定容體積，mL；W——樣品稱(chēng)樣量，g；注：計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。g/kg目標(biāo)化合物。 水解于離心殘留物中加50181。 氯化鈉于 1000mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度液態(tài)混合凈化試劑 移取 5mL 正己烷與 5mL 容量瓶中混勻甲酸溶液（%） 移取甲酸 1mL 于 1000mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻甲酸溶液（%） 移取甲酸 2mL 于 1000mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻甲醇水（50+50）溶液 甲醇與水等量混合，搖勻 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)溶液（1）實(shí)驗(yàn)所用到的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)如下：表 24 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度及其生產(chǎn)廠(chǎng)家名稱(chēng) 純度 生產(chǎn)廠(chǎng)家AMOZ %～％ SigmaAldrich 公司SEM %～％ SigmaAldrich 公司AOZ %～％ SigmaAldrich 公司AHD %～％ SigmaAldrich 公司AMOZD5 ％～ % Witega 公司SCA13C15N2 ％～ % Witega 公司AOZD4 ％～ % Witega 公司AHD13C3 ％～ % Witega 公司第二章 實(shí)驗(yàn)方法 3 （2）實(shí)驗(yàn)所用到的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制如下：表 25 標(biāo)準(zhǔn)溶液及其配制方法溶液名稱(chēng)及濃度 配制方法標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1mg/mL）分別精確稱(chēng)取50mgAOZ、AMOZ 、SEM 、AHD 至50mL 容量瓶中，用甲醇在超聲波水浴中溶解，然后甲醇定容到刻度，混合均勻混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（10μg/mL）移取 AOZ、AMOZ 、SEM 、AHD 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各 500181。如果能研制出檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物的試劑盒，使其與同類(lèi)進(jìn)口試劑盒相比在靈敏度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、回收率方面接近或者優(yōu)于進(jìn)口試劑盒，則能彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白。近幾年歐盟、美國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)從我國(guó)進(jìn)口的動(dòng)物源性食品都要求嚴(yán)格檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)藥物及其代謝物。高效液相色譜(HPLC) 方法的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化、精確度高、假陽(yáng)性率低，缺點(diǎn)是儀器昂貴、操作繁瑣、樣品處理復(fù)雜、成本高、廢棄試劑易造成環(huán)境污染、需要專(zhuān)業(yè)分析人員。由于硝基呋喃類(lèi)抗生素代謝迅速，目前國(guó)外報(bào)道的免疫分析方法都是針對(duì)硝基呋喃類(lèi)抗生素代謝物的ELISA方法。添加實(shí)驗(yàn)是在陰性樣品中加入AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液后按樣品前處理和樣品分析進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)(雙抗體反應(yīng) )。此方法測(cè)定簡(jiǎn)便，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r，試樣回收率在95%~102% 之間。彭濤等 [11]利用LCMS/MS方法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物肌肉組織中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。歐盟 EEC/657/2022指令規(guī)定對(duì)于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到四個(gè)確證點(diǎn)(一個(gè)質(zhì)譜離子為一個(gè)確證點(diǎn))。Robert Kennedy[20]利用LCMS方法測(cè)定豬組織中呋喃唑酮的代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)，組織樣品先用甲醇水反復(fù)溶解洗滌并用2硝基苯甲醛衍生化后分析測(cè)定。目前HPLCMS 連用技術(shù)已經(jīng)成為制藥業(yè)、藥物分析與研制等領(lǐng)域十分重要的分析方法，在環(huán)境分析中也起著重要作用，同時(shí)也是生物化學(xué)和生物技術(shù)大量使用的工具。AlawiMA [17]利用改進(jìn)的HPLC/ELCD 高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)雞組織和雞蛋中的呋喃唑酮和鹽酸呋喃它酮。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=11)分別為 %、%、%(Height)%、%、%(Area)，檢測(cè)限分別為4ng/ml(Height) 和4ng/ml(Area)。于慧娟等 [14]利用高效液相色譜法(配有紫外檢測(cè)器)測(cè)定水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量，其方法靈敏度高。 高效液相色譜法 (HPLC)（1）液相色譜紫外檢測(cè)器(LCUV)在硝基呋喃類(lèi)抗生素原藥化合物的檢測(cè)中高效液相色譜應(yīng)用最多，而高效液相色譜最常用的檢測(cè)器就是紫外檢測(cè)器(UV，包括二極管陣列檢測(cè)器DAD)。 在線(xiàn)透析和微量富集技術(shù)[9]等報(bào)道在線(xiàn)透析和微量富集技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物源性食品肉類(lèi)、奶類(lèi)和蛋類(lèi)中硝基呋喃的分析。有學(xué)者報(bào)道用非極性吸附劑如反相 C18 或者 XAD2 可獲得高的回收率，然而在許多情況下，非極性吸附劑在從萃取物中除去干擾物的凈化過(guò)程并不理想，一些極性吸附劑例如硅膠、氧化鋁或者氨丙基材料也常常被采用，以達(dá)到更好的萃取凈化效果。實(shí)驗(yàn)證明，在酸性條件下，乙酸乙脂、二氯甲烷對(duì)溶液中的硝基呋喃殘留物萃取效果好，也有加入氯化鈉以進(jìn)一步提高二氯甲烷萃取效率的報(bào)道。第一章 引 言 5 SEM、AOZ、AHD 和 AMOZ 的相對(duì)分子質(zhì)量分別為、在此質(zhì)量范圍內(nèi)，MS 噪音大，加上分析物較低的離子化效率和無(wú)特征的碎片行為，MS 檢測(cè)靈敏度很低，給定量特別是定性帶來(lái)困難。常用的有機(jī)溶劑包括乙腈、乙酸乙脂、二氯甲烷等。加大投入，盡快建設(shè)完善我國(guó)動(dòng)物源性食品的獸藥殘留監(jiān)控體系，形成國(guó)家、省、市、縣完整的獸藥殘留檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)梯級(jí)結(jié)構(gòu)；加快我國(guó)獸藥殘留監(jiān)控檢測(cè)方法的研究步伐，發(fā)展簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確靈敏的分析技術(shù)；加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)、加工和流通環(huán)節(jié)的監(jiān)管，加大對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)、加工廠(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等畜禽及產(chǎn)品的抽樣檢測(cè)力度。嚴(yán)格按照獸藥管理?xiàng)l例、獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范GMP 和獸藥經(jīng)營(yíng)管理規(guī)范GSP 的要求規(guī)范生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)行為，加大對(duì)生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)企業(yè)的監(jiān)督管理，嚴(yán)厲查處生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)禁用藥的行為。歐盟EEC2377/90 規(guī)定動(dòng)物源性食品中不得檢出硝基呋喃 (包括呋喃唑酮)。歐盟(EU)從 1997 年開(kāi)始將所有的硝基呋喃類(lèi)抗生素全部列為違禁藥物。硝基呋喃類(lèi)化合物是直接致變劑，它不用附加外源性激活系統(tǒng)就可以引起細(xì)菌的突變。呋喃妥因內(nèi)服吸收較快，體內(nèi)消除快，此藥由尿的排出量大，故主要用于治療尿道感染；而呋喃西林在本類(lèi)藥物中毒性最大，主要用作局部或創(chuàng)傷的感染的外用消毒劑。硝基呋喃類(lèi)抗生素主要包括呋喃唑酮(Furazolidone) 、呋喃它酮(Furaltadone)、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃妥因(Nitrofurantoin)等，見(jiàn)圖 11，呋喃類(lèi)物質(zhì)均為性質(zhì)穩(wěn)定的黃色粉末，無(wú)味或味微苦。呋喃唑酮用于防治水生動(dòng)物疾病，如用1μg/kg~2 μg/kg防治觀(guān)賞魚(yú)蛀鰭爛尾病和羅非魚(yú)潰爛病。（2）具有致癌致畸致突變。這些代謝物可以在弱酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)，因此，當(dāng)人類(lèi)吃了含有硝基呋喃類(lèi)抗生素殘留的食品，這些代謝物就可以在人類(lèi)胃液的酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)被人體吸收而對(duì)人類(lèi)健康造成危害。我國(guó)農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[2022]號(hào)也規(guī)定動(dòng)物源性食品中呋喃唑酮的檢出限為不得檢出。第一章 引 言 3 （1）加強(qiáng)培訓(xùn)與宣傳，提高安全用藥意識(shí)。養(yǎng)殖過(guò)程是獸藥殘留監(jiān)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，養(yǎng)殖者是動(dòng)物源性食品安全的主體，其安全用藥與否直接關(guān)系到食品安全。粉碎后的樣品，用水、氯化鈉溶液或鹽酸溶液混合均相；奶類(lèi)和蜂蜜等樣品的處理，可直接用水或鹽酸溶液混合均勻。2NBA 是采用最多的衍生化試劑，該類(lèi)衍生物在色譜柱上有較好的保留，在質(zhì)譜儀上有特征的離子碎片，靈敏度高。常用的凈化技術(shù)包括傳統(tǒng)的液液萃取（LLP） 、固相萃?。⊿PE ） 、基體固相分散技術(shù)（MSPD ） 、在線(xiàn)透析和微量富集技術(shù)。 固相萃取技術(shù)（SPE）固相萃取技術(shù)是一種色譜凈化技術(shù)。SPE 的特點(diǎn)包括穩(wěn)定可靠，有更好的重現(xiàn)性和高的回收率，不會(huì)產(chǎn)生不溶現(xiàn)象，可消除乳化，減少溶劑的使用，可用于大范圍內(nèi)的不同基質(zhì)?，F(xiàn)在各研究機(jī)構(gòu)已開(kāi)始關(guān)注其代謝物的檢出，國(guó)內(nèi)外報(bào)道過(guò)用于檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)抗生素及其代謝物殘留的方法主要有色譜分析方法及其聯(lián)用技術(shù)、分光光度法、免疫分析法等。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法適用于雞的肌肉、肝臟、腎臟組織和魚(yú)肉中呋喃唑酮?dú)埩袅康臋z測(cè)，在雞的肌肉組織、肝臟、腎臟、魚(yú)肉組織中的檢測(cè)限分別為50、50、25μg/kg，回收率分別為80%~110%、 60%~130%、50%~140%、70%~120%。樣品經(jīng)提取凈化后，以(28∶72)%的冰醋酸為流動(dòng)相，在NovaPakC18柱上分離，CoulochemⅡ檢測(cè)器檢測(cè)(工作電極為多孔石墨電極，工作電位600mV)。6)%、(83177。近些年來(lái)，高效液相色譜配合質(zhì)譜技術(shù)(LCMS)測(cè)定硝基呋喃類(lèi)代謝物在動(dòng)物組織中的殘留越來(lái)越多被采用，與用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)方法比較，質(zhì)譜檢測(cè)器技術(shù)具有定性、定量準(zhǔn)確，抗干擾能力強(qiáng)，檢測(cè)限低，測(cè)定快速等特點(diǎn) [17]。呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮利用HPLCMS方法檢測(cè)限分別為、。由此可見(jiàn)LCMS 是一種靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)、快速的分析確證硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的方法。四種硝基呋喃類(lèi)抗生素代謝物第一章 引 言 11 AOZ、 AMOZ、SC 、定量限分別是、測(cè)定響應(yīng)值的線(xiàn)性范圍從檢測(cè)限到 800ng/g之間。目前，我國(guó)已將液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS)作為測(cè)定蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法(GB/)，從2022年8月1日開(kāi)始實(shí)施。羅杰、李健 [29]建立了呋喃唑酮間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法，將呋喃唑酮與牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)聯(lián)接，分別作為免疫原及包被原，建立了水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物組織中呋喃唑酮的ELISA篩選方法，測(cè)定的最適范圍為10~100ng/ml，最小檢測(cè)限為1ng/ml。在450nm 處測(cè)量( 選擇參比波長(zhǎng)600nm)，吸光度與樣品中的 AOZ濃度成反比。在所有恒溫孵育過(guò)程中，應(yīng)避免光線(xiàn)照射，用試劑盒中提供的蓋板蓋住微孔板。方法同LCMS/MS方法的相關(guān)性很好，r。高效液相色譜法以及各種聯(lián)用技術(shù)是硝基呋喃類(lèi)抗生素及其代謝物的最終確證性的檢測(cè)方法。而且國(guó)外也已經(jīng)開(kāi)發(fā)出呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物商品化的試劑盒。 儀器和設(shè)備實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器及設(shè)備如下：表 21 主要儀器和設(shè)備及其型號(hào)或容量?jī)x器及設(shè)備名稱(chēng) 型號(hào)或容量液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜儀 Agilent1100， API4000，配有電噴霧離子源離心機(jī) Eppendorf 5810R高速組織搗碎機(jī) IKA T25氮?dú)鉂饪s裝置 PIERCE MODEL 1878快速混勻器 IKA MS2固相萃取真空裝置 SUPELCO 公司Eppendorf 移液器 ，均質(zhì)器 UltraTurrax恒溫振蕩裝置 MEMMER分析天平 Shimadzu SEU210一次性注射式濾器 配有 微孔濾膜聚四氟乙烯離心管 50mL棕色雞心瓶 100mLAgilent HPLC 微量進(jìn)樣瓶 pH 計(jì) 上海康儀 PHS3C 型，測(cè)量精度177。 分析步驟 洗樣稱(chēng)取 177。（2）乙酸乙酯提取及 EN SPE 柱凈化（適用于高度渾濁濾液，如蝦、肝、蚌等樣品）將過(guò)濾后上清液加入到 LiChrolut EN 柱中， （預(yù)先用 3mL 乙酸乙酯、3mL甲醇和 5mL 水進(jìn)行活化） ，用 3mL 水洗滌，壓干，直至其吸附劑的顏色由棕色變?yōu)槌壬?，?3mL 乙酸乙酯洗脫分析物，洗脫液經(jīng)氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?1mL流動(dòng)相溶解，過(guò) 濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。 定量方法以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比為縱坐標(biāo)，工作溶液濃度（μg/kg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行定量。AOZ:)表 31 硝基呋喃代謝物及內(nèi)標(biāo)參考保留時(shí)間藥物名稱(chēng) 保留時(shí)間/minAMOZAMOZD5 SEMSCA13C15N2 AHDAHD13C3 AOZAOZD4 樣品衍生條件的優(yōu)化四種硝基呋喃代謝物的分子量在102~201之間，在這個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)質(zhì)譜背景噪音很大，四種代謝物的電離效率又比較低。 質(zhì)譜條件的優(yōu)化采用ESI正離子電離模式，通過(guò)掃描確定4種組分的母離子MS 2及確定子離子，再采用自動(dòng)和手動(dòng)優(yōu)化相結(jié)合的方式對(duì)每種硝基呋喃類(lèi)代謝物及內(nèi)標(biāo)物子離子進(jìn)行CE、DP 、EP、 CXP的化合物條件及IE、 CUR、NEB、TEM、GAS 2等離子源條件的優(yōu)化，兼顧各成分的靈敏度的不同而對(duì)離子源條件有所偏重，建立了質(zhì)譜條件，見(jiàn)表32，和4種硝基呋喃代謝物及各自?xún)?nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的監(jiān)測(cè)離子圖譜，見(jiàn)圖33，34，35，36 。第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 15 圖 37 衍生化后的硝基呋喃代謝物斷裂方式 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖譜及線(xiàn)性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖譜硝基呋喃類(lèi)代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖譜如下：圖38 呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖譜第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 16 圖39 呋喃它酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖譜圖310 呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖譜第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 17 圖311 呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖譜該加入標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的編制基于五個(gè)濃度水平，向動(dòng)物組織及水產(chǎn)品中加入的濃度如下：， 和 ㎏。另外是采用固相萃取柱凈化，實(shí)驗(yàn)了Oasis Max(60mg,3ml Waters)，Oasis HLB