第三章核酸技術(存儲版)
【正文】 2) DNA移動時間： DNA分子向前移動的時間（ Tm） 3) 電場脈沖時間：其電場方向所持續(xù)的時間（ Tp） 分子量大的 DNA分子所需的松弛時間長，分子量小的則短。 mRNA翻譯產(chǎn)物 ， 基因表達產(chǎn)物測定等 。 DNA雙鏈互補，但組成不一樣，仍可分離（機理不詳），電泳時形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。 3. 多聚核糖體 RNA的制備 1) 多聚核糖體的分離 ① 超速離心法（ 3040萬 g，離心 23 h） ② 鎂鹽沉淀法（ M Mg++） ③ 分級分離法 — 分離特異性多聚核糖體 i. 結合與游離核糖體 的分離，這種方法可避免溶酶體破裂。 苯酚法耗時少，不需昂貴儀器，但操作步驟多，易使 DNA分子斷裂。 1) 基因組大?。? 染色體 細菌 3300~4200kb 酵母 15,000 kb 果蠅 kb 人 3x106 kb 植物 2x105~1x108 kb 天花病毒 288 kb 痘病毒 196 kb 質(zhì)體 幾 ~100以上 kb 線粒體 藻類 線狀 15kb 酵母 環(huán)狀 19~78 kb 植物 環(huán)狀 100~150 kb 動物 (扁蟲到人 )環(huán)狀 15~18 kb 錐蟲 網(wǎng)狀 6000 kb(幼體 ) 短膜蟲 網(wǎng)狀 30,000 kb(幼體 ) (Kioplast） 葉綠體 雙子葉植物 121（菠菜） ~154kb（豌豆） 單子葉植物 151（玉米） ~182kb（浮萍） 藻類 132（裸藻） ~191kb（衣藻） 1) DNA分離純化過程 破碎細胞 + DNA抽提液 (EDTA、去污劑、還原劑 ) 65℃ 溫育 20’ 冰浴冷卻 離心去細胞碎片 苯酚抽提法① CsCl密度梯度離心② 1) 苯酚抽提法 上清液 緩沖液用水飽和苯酚抽提 2~3次 上層液相用氯仿抽至界面無蛋白變性物 上層液相用兩倍體積冷乙醇沉淀 沉淀物用 70%冷乙醇洗滌 ,干燥 溶于緩沖液 加入 RNAase處理除去 RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥 2) CsCl密度梯度離心 上清液 加入固體 CsCl與 EtBr溶液 室溫下超速離心(45,000rpm） 16小時 穿孔取出 DNA（ 320nm） 異丙醇抽提溴乙錠 緩沖液透析除去殘余 CsCl 兩倍體積冷乙醇沉淀DNA 離心、洗滌、干燥 *兩種方法比較： CsCl法操作步驟少，分離 DNA分子量大，耗財多，且需超速離心機。在 RNA制備中，細胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進行的。 4) 環(huán)狀 dsDNA電泳 : 常用于質(zhì)粒 DNA的初步鑒定 5) 線狀 ssDNA電泳 鏈分離凝膠 ：化學定序時，用于單鏈分離。 差別：有無變性劑 用途：非變性凝膠可用于蛋白質(zhì)的分離純化過程中 ， 可直接用于酶促反應 （ 顏色變化 ） SDSPAGE可用于蛋白質(zhì)分子量 、 亞基組成的測定 。 脈沖場凝膠電泳 (pulsefield gel electrophoresis， PFGE) PFG工作假說 1) DNA松弛時間：大分子 DNA改變形狀和重新定向所需的時間。 一組電極，電場方向不變，電極排列均勻， 定時改變電場方向， DNA分子的凈 DNA移動方向與電場方向相同。 但讓其修復后，又可形成帶，但有的發(fā)生了重排，導致 帶型變化 2）非洲錐蟲：變異表面糖蛋白基因的表達 4. 疾病的診斷 引起某種皮膚病的原生動物 Leishmania, 具有其特征性的染色體。 為了克服同移動現(xiàn)象產(chǎn)生（即不同大小 DNA分子一起移動），可以采用 轉(zhuǎn)換時間遞增法 （ swichinginterval ramps） ,
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