單克隆抗體技術(shù)ppt課件(存儲版)
【正文】 分 開 ? 骨髓瘤細(xì)胞系選擇要點(diǎn)： ? 穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌 Ig、融合率高、HGPRT缺陷株 ? 常用骨髓瘤細(xì)胞系有： NS SP2／ 0、 X63 等。 ● 若有 許 多抗原決定基， 則 需 許 多株 B 細(xì)胞分別生 產(chǎn)許 多抗體 。 2 鼠單抗可變區(qū)的人源化 盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。 研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進(jìn)行 CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括 對影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列 進(jìn)行操作。 把 Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。 如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用 PCR方法 擴(kuò)增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。 (3)單域抗體 VH 約為完整分子的 1/801/70大小，一般由一個 CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。同樣地 ,將 VHA與 VLB連接 ,將兩組嵌合基因 置于雙順反子的表達(dá)質(zhì)粒中 ,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒 ,目前報道的表達(dá)質(zhì)粒均為雙順反子。 它是在 PCR技術(shù)和 Phage Display的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。 抗體基因篩選的范圍廣 。 。 篩選到的噬菌體再將基因 g3或 g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) : 將 抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系 起來 。 噬菌體表面展示文庫技術(shù)。 即能 結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞 又能 結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞 ,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍 ,而且可以模擬天然配體的作用 ,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合 ,激活效應(yīng)細(xì)胞 ,實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱 單域抗體。 單鏈抗體 的構(gòu)建在已知親本 DNA序列時可用完全人工合成法 。 易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。合成所有 DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點(diǎn)突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。 ● 完全人源化單抗現(xiàn)有多個處于臨床前階段 多克隆抗體 Epitope, Antigenic determinant 抗原決定基 ● 一 個 抗原分子上可能 有 數(shù)個 抗原決定基 ● 每個 抗原決定基 至少誘生一種 專一性抗體 ● 蛋白 質(zhì) 性 抗原決定基 含有 六 個 以上 氨 基酸 整體水平抗體生成技術(shù) 細(xì)胞工程抗體生成技術(shù) 基因工程抗體生成技術(shù) 多克隆抗體（抗血清） 單克隆抗體 嵌合抗體、改形抗體 “小型化抗體”（單鏈抗體） 組合抗體庫技術(shù) 噬菌體抗體庫技術(shù) Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠 抗體真核表達(dá)技術(shù) 多克隆抗體（ polyclonal antibody） 指由不同 B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。單克隆抗體技術(shù) 疫苗和抗體的研制，是生物技術(shù)發(fā)展的永恒主題。 ● 美國已占全球單抗市場 90%—一支獨(dú)秀。 ? 可溶性抗原 1015ug/100ul+等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔 24周后加強(qiáng)免疫（量減半，改用不完全佐劑，可反復(fù)多次） 沖擊免疫（融合前 3天進(jìn)行） ? 選用 612周齡 Balb/c小鼠 ? 顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果 ? 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑 ? 目前，用于可溶性抗原 (特別是一些弱抗原 )的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。 ? 克隆化：指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。 人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。 全合成法 是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的 CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。 在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出 。常用的連接肽是 (GGGGS)3。 即為 VH，約為完整分子的 1/12。另 1種為對應(yīng)效應(yīng)成分。
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