【正文】 ins into the folded structure. So, pairs of ideal positions needed to be sought in order to acmodate disulfide bridges. Disulfide bridges increase protein stability (contd.) Three candidate disulfide bridges remained after this long filtering process: 397, 9164, 21142 (by the way, Cys54 was mutated to Thr to avoid the formation of incorrect disulfide bonds during folding). Disulfide bridges increase protein stability (contd.) 176。 C) Asn144Asp (Tm increase of 2176。 C) Glycine and proline have opposite effects on stability (contd.) The threedimensional structures of these mutant enzymes were also determined: the Ala82Pro mutant had a structure essentially identical to the wildtype except for the side chain of residue 82。 ? 計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)包括能量表達(dá)、能量優(yōu)化、側(cè)鏈構(gòu)象的離散化、殘基分類 (內(nèi)核、表面、邊界 )、功能位點(diǎn)設(shè)計(jì)、專一性、穩(wěn)定性及序列空間的穩(wěn)健性預(yù)測等方面內(nèi)容。 四 . 天然蛋白質(zhì)的剪裁 分子剪裁： 替換蛋白質(zhì)分子的一個(gè)肽段，或 一個(gè)結(jié)構(gòu)域 1） 抗體工程（ Chapter VI） 2） Rop 第二節(jié) 全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì) ? 特征： 全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是另一類蛋白質(zhì)工程，合成具有特異結(jié)構(gòu)與功能的新蛋白質(zhì)。 三、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中的結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系研究 ? 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系的重要性 ? 定位突變在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中的作用 1. 根據(jù)結(jié)構(gòu)信息確定殘基的突變：酪氨酰 tRNA合成酶 2. 其他實(shí)驗(yàn)方法鑒定功能殘基 ： HIV1 蛋白酶； GMCSF； 3. 利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基 ：保守殘基 ? 構(gòu)象的探測 定位突變種類 ? 插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基； ? 刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基； ? 替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。 ③所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的 (主鏈及側(cè)鏈 )。如果 PDB中沒有收錄又未見文獻(xiàn)報(bào)道，我們需要通過蛋白質(zhì) X射線晶體學(xué)及 NMR方法測定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，或者通過結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法構(gòu)建該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。 ? 專一性突變產(chǎn)物是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成敗的關(guān)鍵。 蛋白質(zhì)分子的特殊性 ? 蛋白質(zhì)分子功能的重要性 ? 蛋白質(zhì)分子應(yīng)用的局限性 ? 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的脆弱性 蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)設(shè)計(jì) ? 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的必要性 。即使蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是已知的，選擇一個(gè)合適的突變體仍是困難的，這說明蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)任務(wù)的艱巨性，它涉及多種學(xué)科的配合，如計(jì)算機(jī)模擬專家、 X射線晶體學(xué)家、蛋白質(zhì)化學(xué)家、生物技術(shù)專家等的合作與配合。建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，確立突變位點(diǎn)或區(qū)域以及預(yù)測突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對蛋白質(zhì)工程是至關(guān)重要的。 ? Hartley等于 1986年完成了一個(gè)我們所要的有關(guān)蛋白質(zhì)重要性質(zhì)設(shè)計(jì)目標(biāo)及解決辦法表，該表至今仍有參考價(jià)值。 ⑥ 對于金屬蛋白，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。 ? Fersht等替換了 Barnase的所有內(nèi)核殘基。 一、 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì) 1) 二級(jí)結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝 2) 配體誘導(dǎo)組裝 3) 通過共價(jià)交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自組裝： SS；DAB 4) 在合成模板上的肽自組裝 5) 線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu) 6) 基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì) 二、蛋白質(zhì)功能的全新設(shè)計(jì) ? 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)是產(chǎn)生既能折疊為預(yù)想的結(jié)構(gòu)又具有有趣和有用的功能。c 176。 C) Stabilizing the dipoles of ? helices increases stability (contd.) Stabilizing the dipoles of ? helices increases stability (contd.) Mutations that fill cavities in hydrophobic cores do not stabilize T4 lysozyme, although they may stabilize other proteins The elimination of a cavity of the size of one –CH2 group in the protein interior stabilizes the enzyme by about 1 kcal/mol. Results: in T4 lysozyme, Leu23Phe amp。 C) Ala82Pro (Tm increase of 2176。這個(gè)循環(huán)已經(jīng)在蛋白質(zhì)的合理設(shè)計(jì)中得到了許多重要進(jìn)展。 ? 這些結(jié)果說明不同的氨基序列具有相近的設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)。實(shí)踐表明這是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)最困難的問題。 ②所有蛋白質(zhì)內(nèi)部都是密堆積 (很少有空穴大到可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰性氣體 )，并且沒有重疊。當(dāng)我們開始對某一天然蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)時(shí)，首先要查找 PDB了解這個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是否已被收錄。 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)大致涉及的幾個(gè)重要方面 ? 篩選以及純化蛋白質(zhì)需要進(jìn)行細(xì)致的表征，測定它們的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等。 ? 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)方面的主要內(nèi)容與研究進(jìn)展，以及應(yīng)用分子設(shè)計(jì)取得的成功實(shí)例 。 計(jì)算機(jī)模擬 基因構(gòu)建 突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品 功能分析 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán) 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)大致涉及的幾個(gè)重要方面 ? 在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)開始之前，要對所要求的活性進(jìn)行篩選。 ? 在明確突變位點(diǎn)或蛋白質(zhì)序列應(yīng)改變的區(qū)域后，可以進(jìn)行定位突變，但要得到具有預(yù)期結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)是不容易的，可能需要經(jīng)過幾輪的循環(huán)。 設(shè)計(jì)目標(biāo) 解決辦法 熱穩(wěn)定性 對氧化的穩(wěn)定性 對重金屬的穩(wěn)定性 pH穩(wěn)定性 提高酶學(xué)性質(zhì) 引入二硫橋 增加內(nèi)氫鍵數(shù)目 改善內(nèi)疏水堆積 增加表面鹽橋 把 Cys轉(zhuǎn)換為 Ala或 Ser 把 Met轉(zhuǎn)換為 Gln、 Val、 Ile或 Leu 把 Trp轉(zhuǎn)換為 Phe或 Tyr 把 Cys轉(zhuǎn)換為 Ala或 Ser 把 Met轉(zhuǎn)換為 Gln、 Val、 Ile或 Leu 替代表面羧基 替換表面荷電基團(tuán) His、 Cys以及 Tyr的置換