【正文】 成。因此，由氧饑餓而引起的細(xì)胞代謝干擾，可能對形成某些產(chǎn)物是有利的；同理，當(dāng)提供的氧濃度遠(yuǎn)大于臨界值時，雖對菌體形成無妨，但也許能刺激產(chǎn)物的形成；所以，某種產(chǎn)物形成的最佳條件可能不同于菌體生長的最佳通氣條件。但就抑制抗生素生物合成的溶氧濃度來說，對頭孢菌素為低于 1020％；而對卷曲霉素則為 8％。在發(fā)酵過程中， CO2 有可能對發(fā)酵有促進作用，也有可能有抑制作用。 CO2 的控制 CO2 在發(fā)酵液中的濃度變化不像溶解氧那樣有一定的規(guī)律。 另一種泡沫是出現(xiàn)在粘稠的菌絲 發(fā)酵液當(dāng)中。隨著霉菌產(chǎn)生的蛋白酶 /淀粉酶的增多及其對碳、氮源的利用，造成泡沫穩(wěn)定的蛋白質(zhì)分解，培養(yǎng)液粘度降低，促進表面張力提高，泡沫減少。 選擇消泡劑的依據(jù) ?對發(fā)酵過程無毒，對人、畜無害和不影響酶的生物合成。 ?高級醇類 十八醇是較常用的一種，可以單獨或與載體 —起使用。 ?不干擾分析系統(tǒng)，如溶解氧、 pH 測定儀的探頭。采用最優(yōu)的補科程序也是依賴于比生長曲線形SK KcSK SbSKa i iSS ????? m a xm a xm a x ?????? ：；：；：態(tài)、產(chǎn)物生成速率及發(fā)酵的初始條件等情況。在 30L發(fā)酵罐中進行了計算機控制系統(tǒng)與常規(guī)分批加糖方法的比較研究；其結(jié)果見下表。例如生產(chǎn)大曲酒、麩曲酒就是典型的固態(tài)發(fā)酵。進窖時原料淀粉含量不能太高，在發(fā)酵過程中一部分能量被放出，升高了發(fā)酵溫度，一般發(fā)酵過程中，淀粉含量降低 %時，酒醅溫度實際約上 升 2℃左右。但入窖水分過高，會引起糖化和發(fā)酵 作用加快，升溫過猛，使發(fā)酵不徹底；而水分過少，會引起酒醅發(fā)干，殘余淀粉高，酸度過低，槽不柔軟，影響發(fā)酵正常進行；一般大曲酒入窖水分為 53~57％，小曲57~62％，因原料而異，冬天與夏天也不同。罐壓的高低與氧， CO2 在培養(yǎng)液中的溶解度有關(guān)，間接影響菌體代謝。一般控制在 ~ 之間 6，粘度 粘度大小可作為細(xì)胞生長或細(xì)胞形態(tài)的標(biāo)志之一。基質(zhì)濃度的變化對產(chǎn)生菌的生長和產(chǎn)物的合成有重要影響 ，也是提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要控制手段。從而了解產(chǎn)生菌的呼吸代謝規(guī)律。C Pa V/ R/min KW 透光度 l/h 傳感器 壓力表 傳感器 傳感器 傳感器 粘度計 傳感器 傳感器 間接計算 維持生長、合成 維持正壓、增加溶氧 供氧、排泄廢氣、提高 KLa 物料混合、提高 KLa 反映攪拌情況、 KLa 反映菌的生長、 KLa 反映菌的生長情況 反映發(fā)酵代謝情況 反映供氧效率 化學(xué)參數(shù) 參數(shù)名稱 單位 測試方法 意義、主要作用 pH 基質(zhì)濃度 溶解氧濃度 氧化還原電位 產(chǎn)物濃度 尾氣氧濃度 尾氣 CO2 濃 度 g/ml ppm mV g/ml Pa % G(DCW)/ml 傳感器 取樣 傳感器 傳感器 取樣 傳感器 傳感器 了解生長和產(chǎn)物合成 了解生長和產(chǎn)物合成 反映氧供需情況 反映菌的代謝情況 產(chǎn)物合成情況 了解耗氧情況 。尾氣中 CO2 是產(chǎn)生菌呼 吸放出的 CO2。 pH 的高低與菌體生長和產(chǎn)物合成有著重要的關(guān)系。 5，空氣流量 指單位時間內(nèi)單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積。溫度的高低與下列參數(shù)有密切關(guān)系： （ 1）發(fā)酵中的酶反應(yīng)速度 （ 2）菌體生長速度，產(chǎn)物合成速度 （ 3）氧在培養(yǎng)液中的溶解度，傳遞速度 2，發(fā)酵罐維持的壓力。一般控制在 ~ 的酸度。因在窖內(nèi)部沒有冷卻或加熱裝置，這樣只好把進窖溫度控制得比較低 (18~22℃ )。 固態(tài)發(fā)酵（如白酒）； 液態(tài)發(fā)酵（如酒精、丙酮、丁醇、乳酸、啤酒）。從理論上按上式計算可得 K 值似應(yīng)為 。 補料控制的策略 在發(fā)酵過程中，大多數(shù)補料分批發(fā)酵均補加生長限制性基質(zhì)，其策略如下： （ 1）以經(jīng)驗數(shù)據(jù)或預(yù)測數(shù)據(jù)控制流加； （ 2）以 pH、尾氣、溶氧、產(chǎn)物濃度等參數(shù)間接控制流加； （ 3）以物料平衡方程，通過傳感器在線測定的一些參數(shù)計算限制性基質(zhì)的濃度，間接控制流加； （ 4）用傳感器直接測定限制性基質(zhì)的濃度，直接控制 流加。 ?不影響以后的提取過程。 消泡劑的種類和性能 ?天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、魚油及豬油等。 （ 2）化學(xué)消沫法 機理： 當(dāng)泡沫的表層存在著由極性的表面活性物質(zhì)形成雙電層時，可以加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機械強曲或加入某些具有強極性的物質(zhì)與發(fā)泡劑爭奪液 膜上的空間，降低液膜強度，使泡沫破裂。 （ 2）培養(yǎng)基的配比及原材料組成 不同濃度蛋白質(zhì)原科的起泡作用 （ 3）培養(yǎng)基的破壞程度 滅菌時間對泡沫穩(wěn)定性的影響 （ 4）接種量的大小 （ 5）培養(yǎng)液本身性質(zhì)的變化 （ 6）培養(yǎng)基滅菌的方法和操作 （ 7）染菌 6，發(fā)酵過程 泡沫的變化 在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)液的性質(zhì)隨微生物的代謝活動而不斷變化，影響了泡沫的消長，下圖指出了霉菌發(fā)酵過程中的液體表面性質(zhì)與泡沫壽命的關(guān)系。 2，泡沫的類型 一類存在于發(fā)酵液的液面上，這類泡沫氣相所占比例特別大，并且泡沫與它下面的液體之間有能分辮的界線。如對肌苷、異亮氨酸、組氨酸、抗生素等發(fā)酵的抑制 ③影響發(fā)酵液的酸堿平衡 CO2 對發(fā)酵影響的機理 CO2 及 HCO3主要是影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜的流動性及表面電荷密度發(fā)生改變，影響到細(xì)胞膜的輸送效率，導(dǎo)致細(xì)胞生長受到抑制、形態(tài)發(fā)生改變。 四、 CO2 對發(fā)酵的影響及控制 CO2 是微生物的代謝產(chǎn)物，同時也是某些合成代謝的基質(zhì)。 實例二 Feren 和 Squires(1969)對頂頭孢霉產(chǎn)生頭孢菌素和卷曲霉素 (Capreomycin)的研究即是一個氧對次級代謝影響的例子。如果溶氧濃度低于臨界值，則菌體代謝受到干擾。 C 為生產(chǎn) 1 克菌體所需氧的量； Y 為 1 克底物轉(zhuǎn)化成菌體的克數(shù)。如果考慮呼吸的化學(xué)計量，則葡萄糖的氧化可由下式表示： C6H 12O6 十 6O2＝ 6H2O 十 6CO2 只有當(dāng)這兩種反應(yīng)物均溶于水后，才對菌體有用。因此，必須掌握發(fā)酵過程中 pH 的變化規(guī)律，及時監(jiān)測并加以控制，使它處于最佳的狀態(tài)。 μ與 α與溫度有關(guān) 根據(jù) Arrenhnius 公式 μ = AeE/RT α = A’eE’/RT 通常 E’大于 E，所以 α比 μ對溫度變化更為敏感。 輻射熱的計算：輻射熱可通過罐內(nèi)外的溫差求得，一般不超過發(fā)酵熱的 5%。 發(fā)酵過程中生物熱的變化 在四環(huán)素發(fā)酵中，還發(fā)現(xiàn)生物熱和菌的呼吸強度的變化有對應(yīng)關(guān)系，特別是在 80小時以前。培養(yǎng)基中碳水化合物，脂肪，蛋白質(zhì)等物質(zhì)被分解為 CO2,NH3 時釋放出的大量能量。 補料分批發(fā)酵的類型 按補料方式不同可分為： （ 1）連續(xù)流加 （ 2）不連續(xù)流加 （ 3）多周期流加 按補料成分的不同可分為： （ 1）單一組 分流加 （ 2）多組分流加 按控制方式的不同可分為： （ 1）反饋控制 （ 2）無反饋控制 四、連續(xù)發(fā)酵 定義 培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時放出含有產(chǎn)品的相同體積發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)料液量維持恒定，微生物在近似恒定狀態(tài)（恒定的基質(zhì)濃度、恒定的產(chǎn)物濃度、恒定的 pH、恒定菌體濃度、恒定的比生長速率）下生長的發(fā)酵方式。 其動力學(xué)方程為： （ 2） Piret39。當(dāng)生長停止后，菌絲體的自溶裂解的程度，因菌種的本性和培養(yǎng)條件而導(dǎo)。 ③衰退期 真菌生長進入衰退期的標(biāo)志，是菌絲干重下降。 絲狀真菌的生長過程大致可分為；①生長延滯期；②迅速生長期；③衰退期。 一、分批發(fā)酵 分批發(fā)酵的定義 是指在一封閉系統(tǒng)內(nèi)含有初始限量基質(zhì)的發(fā)酵方式 。 微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，而且要賦以合適的環(huán)境條件才能使它的生產(chǎn)能力充分表達出來。 由于菌種衰退的情況不同，對有些衰退原因還不甚了解，因此要切實解決具體問題，需根據(jù)實際情況，通過實驗正確地加以運用。為此，生產(chǎn)菌種每移植一代，最好同時移植較多的斜面，以供一段時間生產(chǎn)之需，這樣移植次數(shù)就可減少。以芽孢桿菌的黃嘌呤缺陷型在斜面上移殖代數(shù)對回復(fù)突變率和產(chǎn)量的關(guān)系為例，如下表所示。 當(dāng)誘變的單菌落是由一個以上孢子或細(xì)胞形成，而其中只有一個孢子或細(xì)胞是高產(chǎn)時，在移接傳代過程中，這個高產(chǎn)菌株數(shù)量減少，當(dāng)然產(chǎn)量也就下降。經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細(xì)胞比休眼狀態(tài)細(xì)胞發(fā)生突變的機率大得多。此外，溫度、 pH、不同碳氮源都會導(dǎo)致菌種變化。該法簡便易行，而且保藏效果較好。 主要包括砂土制備和真空抽干兩步。 這種保藏方法簡單，存活率高，易于推廣，經(jīng)常使用的菌種可采用這種方法。 1，實驗室擴大培養(yǎng) 2，車間擴大培養(yǎng) 第三節(jié) 生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種 生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個方面：從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個種子罐；從一個種子罐移入另一個生產(chǎn)發(fā)酵罐中。 2，一級種子培養(yǎng) 一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多含有機氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考慮。因此在生產(chǎn)過程中通常進行以下兩項檢查。 不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過 多種實驗來確定。 二、影響種子質(zhì)量的因素及控制 生產(chǎn)過程中影響種子質(zhì)量的因素通常有：孢子的質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡、接種量。過于衰老的孢子會導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。 2，培養(yǎng)條件 （ 1）溫度 溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。 1，培養(yǎng)基 生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。 二、生產(chǎn)車間種子制備 實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)溫度一般為 28℃。對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。如細(xì)菌、酵母菌、放線菌或霉菌生長的快慢；產(chǎn)孢子能力的大??；及對營養(yǎng)、溫度、需氧等條件的要求均有所不同。其生產(chǎn)方法與條件隨不同的生產(chǎn)品種和菌種種類而異。 第一節(jié) 種子的制備過程 在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，種子制備的過程大致可分為兩個階段： （ 1）實驗室種子制備階段 （ 2）生產(chǎn)車間種子制備階段 一、實驗室種子的制備 實驗室種子的制備一般采用兩種方式： 對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。 3，放線菌孢子的制備 放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。從三角瓶到卡氏培養(yǎng)罐培養(yǎng)期間，均需定時搖動或通氣，使酵母菌液與空氣接觸，以有利與酵母菌的增殖。 第二節(jié) 種子質(zhì)量的控制 一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制 影響孢子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間和冷藏時間等。 解決措施： （ 1）培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用； （ 2）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量； （ 3）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時間； （ 4）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的 培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機氮源。 表 71 不同相對濕度對龜裂鏈霉菌斜面生長的影響 相對濕度（ %） 斜面外觀 活孢子計數(shù)（億 /支） ~19 25~36 40~45 上部稀薄、下部稠略黃 上部薄、中部均勻發(fā)白 一片白，孢子豐富，稍皺 3，培養(yǎng)時間和冷藏時間 （ 1）培養(yǎng)時間 一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進入發(fā)芽階段，核物 質(zhì)趨于分化狀態(tài)。 4，接種量 接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù) 量，進而影響菌體的生理狀況。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)