【正文】 種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開(kāi)始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。如嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶， 12 小時(shí)最好（見(jiàn)下圖）。過(guò)大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會(huì)過(guò)多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過(guò)小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。 （ 1）菌種穩(wěn)定性的檢查 （ 2）無(wú)（雜菌）檢查 四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1，細(xì)胞或菌體 菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等） 單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)； 霉菌、放線 菌：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。 五、種子異常分析 菌種生長(zhǎng)速度，過(guò)快或過(guò)慢 菌絲結(jié)團(tuán) 菌絲粘壁 第三節(jié) 實(shí)例 一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 斜面菌種→一級(jí)種子培養(yǎng)→二級(jí)種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐 1，斜面菌種的培 養(yǎng) 菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長(zhǎng)而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對(duì)純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含或少含糖為原則。 (1)培養(yǎng)基組成 葡萄糖 %，尿素 %，硫酸鎂 %，磷酸氫二鉀 %，玉米漿 ~%(按質(zhì)增減 )，硫酸亞鐵、硫酸錳各 2ppm， 。 3，二級(jí)種子培養(yǎng) 為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級(jí)種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)而擴(kuò)大到種子罐的二級(jí)種子培養(yǎng)。 （ 1）從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器接種 通常有兩種方式 2，從種子罐接種 第四節(jié) 菌種的保藏與復(fù)壯 一、菌種的保藏 菌種保藏的意義 菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開(kāi)菌種。一般可通過(guò)保持培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分在最低水平 缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于 ―體眠 ‖狀態(tài)，抑制其繁殖能力。其缺點(diǎn)是菌種仍有一定強(qiáng)度的代謝活動(dòng)條件，保存時(shí)間不長(zhǎng)，而且傳代多，因此菌種客易產(chǎn)生變異。 （ 3）砂土管保藏法 將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅過(guò)菌的砂土管中，于真空干燥器內(nèi)用真空泵抽干，再轉(zhuǎn)至有干燥劑的容器中，密封低溫保藏。 （ 4）冷凍干燥法 此法的原理是在低溫下迅速將細(xì)胞凍結(jié)以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。其缺點(diǎn)是手續(xù)麻煩，操作復(fù)雜，要求嚴(yán)格，并需有一定設(shè)備條件。 二、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的衰退與復(fù)壯 微生物具有生命活動(dòng)能力，其世代時(shí)間一般是很短的，在傳代過(guò)程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此常常造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化，并有可能使優(yōu)良菌種丟失，所以，如何保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定是研究菌種保藏的重要課題。對(duì)誘變育種而獲得的高產(chǎn)變異株則常表現(xiàn)出恢復(fù)野生型性狀等。但只要一旦恢復(fù)正常條件，這些現(xiàn)象就會(huì)消失。 引起菌種退化的原因主要有： 基因突變 菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。在發(fā)酵生產(chǎn)中常用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，如缺 陷型發(fā)生回復(fù)突變就會(huì)使產(chǎn)量水平下降。 變異菌株性狀分離 變異菌株性狀分離也會(huì)引起高產(chǎn)型狀的喪失。即使菌落是由一個(gè)孢子或單個(gè)細(xì)胞形成，只要它是多核細(xì)胞，在誘發(fā)突變中核的變化不會(huì)都一樣，隨著菌種傳代和核的分離也會(huì)使性狀表現(xiàn)多樣化，產(chǎn)量也會(huì)隨之變化，即使是單核孢子發(fā)生突變時(shí)，如果雙鏈 DNA 上僅一條鏈上某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化，經(jīng)移殖后也會(huì)出現(xiàn)性狀分離。 不同劑量紫外線處理裂殖酵母時(shí)不純菌落百分?jǐn)?shù) 劑量 （以存活率計(jì)， %） 菌落總數(shù) 突變菌落數(shù) 突變頻率 （突變菌落 /103） 不 純 菌 落（ %） 純 不純 100（對(duì)照） 80~100 60~80 20~60 1~20 12165 12060 8553 4922 9884 1 13 46 65 195 — 12 20 17 28 2 27 — 43 30 21 13 誘變突變株的穩(wěn)定性和誘變劑作用機(jī) 制有關(guān)，一般認(rèn)為誘發(fā) DNA 堿基轉(zhuǎn)換或顛換時(shí)不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較多，而誘發(fā)缺失交界時(shí)不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較少，因?yàn)槿笔遣荒芑貜?fù)的。 產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過(guò)程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系 實(shí)驗(yàn) 移接代數(shù) 每代斜面保存時(shí)間（天） 回復(fù)子比數(shù) 腺苷產(chǎn)量 （ g/L） 1 2 3 4 5 6 0 2 6 7 9 12 147 133， 14 47， 3， 9， 3， 71， 14 47， 3， 9， 3， 13， 58， 14 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 47， 4 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 4， 14， 6， 6， 31 1/ 106 1/ 106 1/ 105 1/ 105 1/ 103 1/ 103 由上表可見(jiàn)，雖菌種總的保存時(shí)間都是 147 天，但隨著移植代數(shù)的增加，回復(fù)突變率也增加，腺 苷產(chǎn)量下降。 （二）防止菌種衰退和退化菌種的復(fù)壯 防止菌種衰退 防止菌種衰退的方法有： （ 1）控制傳代次數(shù) 基因的變化往往發(fā)生在復(fù)制和繁殖過(guò)程中，繁殖越頗繁，復(fù) 制的次數(shù)越多，基因發(fā)生變化的機(jī)會(huì)也就越多。 （ 2）選擇合適的培養(yǎng)條件 培養(yǎng)條件對(duì)菌種衰退有一定的影響，選擇一個(gè)適合原種生長(zhǎng)的條件可以防止菌種衰退。但是這也必須注意到微生物細(xì)胞本身的特點(diǎn)。 退化菌種的復(fù)壯 使衰退的菌種重 新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性，稱為復(fù)壯。但這工作量不亞于新突變株的誘變育種，另外，用遺傳方法選育不易退化的穩(wěn)定菌株或采用雙缺、三缺菌株及減少傳代次數(shù)等方法，都可防止菌種退化，保存穩(wěn)定菌株。為此我們必須通過(guò)各種研究方法了解有關(guān)生產(chǎn)菌種對(duì)環(huán)境條件的要求，如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、 pH、氧的需求等，并深入地了解生產(chǎn)菌在合成產(chǎn)物過(guò)程中的代謝調(diào)控機(jī)制以及可能的代謝途徑，為設(shè)計(jì)合理的生產(chǎn)工藝提供理論基礎(chǔ)。 代謝曲線：代謝變化是反映發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)，發(fā) 酵參數(shù)（培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件等）和產(chǎn)物形成速率三者間的關(guān)系。在這一過(guò)程中，除了氧氣、消泡劑及控制pH 的酸或堿外，不再加入任何其它物質(zhì)。 不會(huì)產(chǎn)生菌種老化和變異等問(wèn)題 缺點(diǎn)： 非生產(chǎn)時(shí)間較長(zhǎng)、設(shè)備利用率低。 ①生長(zhǎng)延滯期 造成生長(zhǎng)延滯的原因有兩種：一是孢子萌發(fā)前的真正的延滯期，另一種是生長(zhǎng)已開(kāi)始但卻無(wú)法測(cè)量。真菌的生長(zhǎng)常表現(xiàn)為菌絲尖端的生長(zhǎng)和菌絲的分枝，因此受到鄰近細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)的影響。一般是在一短期內(nèi)失重很快，以后不再變化。在高濃度培養(yǎng)基中，可能是因?yàn)橛卸敬x產(chǎn)物的積累而阻礙生長(zhǎng)，如在高濃度碳水化合物的培養(yǎng)基中可積累有機(jī)酸；在含有機(jī)氮高的培養(yǎng)基中可積累氨。 分批發(fā)酵的類型 通常有兩種分類方式： （ 1） Gaden39。例如，檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵。s fermentation classification （按照產(chǎn)物生成與菌體生長(zhǎng)是否同步） ①生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型 (第一類型 ) 形成與生長(zhǎng)有關(guān)，如酒精、某些酶等。 7，典型的分批發(fā)酵工藝流程 ）：比生長(zhǎng)速率（）物的率（：菌體生長(zhǎng)為基準(zhǔn)的產(chǎn)）產(chǎn)物形成比速率（hYQYQggLhgxPPxPP1////:?????? 二、補(bǔ)料分批 發(fā)酵 定義 補(bǔ)料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵或流加分批發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過(guò)程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方式。 連續(xù)發(fā)酵的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 能維持低基質(zhì)濃度； 可以提高設(shè)備利用率和單位時(shí)間的產(chǎn)量； 便于自動(dòng)控制。 （ 2）散熱因素：蒸發(fā)熱和輻射熱。 用途：合成高能化合物，供微生物生命代謝活動(dòng)，熱能散發(fā)。生物熱的大小還與菌體的呼吸強(qiáng)度有對(duì)應(yīng)關(guān)系。從此實(shí)驗(yàn)中還可看到，當(dāng)產(chǎn)生的生物熱達(dá)到高峰時(shí)，糖的利用速度也最大?？諝膺M(jìn)入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進(jìn)行熱交換。 3，發(fā)酵熱的測(cè)定 （ 1）通過(guò)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)冷卻水的流量和冷卻水進(jìn)出口溫度，由下式求得這段時(shí)間內(nèi)的發(fā)酵熱。當(dāng)溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高。 例：青霉菌生產(chǎn)青霉素 青霉菌生長(zhǎng)活化能 E=34kJ/mol 青霉素合成活化能 E=112kJ/mol 青霉素合成速率對(duì)溫度較敏感，溫度控制相當(dāng)重要。溫度的選擇要參考其它發(fā)酵條件。盡管多數(shù)微生物能在 3~4 個(gè) pH 單位的 pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但是在發(fā)酵工藝中，為了達(dá)到高生長(zhǎng)速率和最佳產(chǎn)物形成，必須使 pH 在很窄的范圍內(nèi)保持恒定。 最適 pH 與菌株，培養(yǎng)基組成，發(fā)酵工藝有關(guān)。 氧在水中的溶解度比葡萄糖要小約 6000 倍左右 (氧在水中的飽和度約為 l0mg/L) 。從這些測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌體的需氧似乎 完全取決于培養(yǎng)基中的碳源。 因此， A/Y 為燃燒生成 1g菌體的底物所需的氧，而 B為燃燒菌體所需氧的量；它們之間的差為C，即為轉(zhuǎn)化底物成菌體所需氧的量。溶氧濃度對(duì)比攝氧率 (QO2 每克干菌體每小時(shí)所消耗的氧的毫摩爾數(shù) )用米氏型曲線表示。但是，發(fā)酵工業(yè)的目標(biāo)是要得到菌體發(fā)酵的產(chǎn)物而不是菌體本身。因此，氧安全值低于最大呼吸率就意味著其溶氧濃度低于臨界值。他們的研究表明，頭孢菌素產(chǎn)生菌的臨界氧濃度在 0~7％的空氣飽和度間；而對(duì)卷曲霉素產(chǎn)生菌則為 13~23％。 發(fā)酵中后期，溶氧濃度明顯地受工藝控制手段的影響，如補(bǔ)料的數(shù)量、時(shí)機(jī)和方式等。它是細(xì)胞代謝的重要指標(biāo)。 （ 2） CO2 對(duì)發(fā)酵的影響 ①對(duì) 發(fā)酵促進(jìn)。 培養(yǎng)液中的 CO2 主要作用于細(xì)胞膜的脂質(zhì)核心部位； HCO3影響細(xì)胞膜的膜蛋白。 五、發(fā)酵過(guò)程中的泡沫及其控制 1，泡沫的性質(zhì) 泡沫是氣體被分散在少量液體中的膠體體系。如在某些稀薄的前期發(fā)酵液或種子培養(yǎng)液中所見(jiàn)到的。 3，泡沫產(chǎn)生的原因 （ 1）由外界引進(jìn)的氣流被機(jī)械地分散形成（通風(fēng)、攪拌）； （ 2）發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的氣體聚結(jié)生成（發(fā)泡性物質(zhì)）。由此可見(jiàn)，發(fā)酵初期泡沫的高穩(wěn)定性與高的表觀粘度和低表面張力有關(guān)。 霉菌發(fā)酵過(guò)程中液體性質(zhì)和泡沫的關(guān)系 7，發(fā)酵過(guò)程泡沫控制的方 法 （ 1）物理消沫法 原理：靠機(jī)械力引起強(qiáng)烈振動(dòng)或者壓力變化，促使泡沫破裂，或借機(jī)械力將排出氣體中的液體加以分離回收。 當(dāng)泡沫的液膜具有較大的表面粘度時(shí)，可以加入某 些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液體流失，導(dǎo)致泡沫破裂。 ?消沫劑的來(lái)源多，價(jià)格低，添加裝置簡(jiǎn)單。 ?聚醚類：在生 產(chǎn)上應(yīng)用較多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油 (又稱泡敵 )。 ?硅酮類 硅酮類消沫劑主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。 ?消沫劑的 來(lái)源多，價(jià)格低，添加裝置簡(jiǎn)單。 補(bǔ)料的內(nèi)容 采用補(bǔ)料控制工藝，可補(bǔ)加的物料包括以下幾類： （ 1）補(bǔ)充微生物能源和碳源的需要； （ 2）補(bǔ)充菌體所需要的氮源； （ 3）補(bǔ)充微量元素或無(wú)機(jī)鹽。 補(bǔ)料控制參數(shù)的選擇 為了有效地進(jìn)行中間補(bǔ)料，必須選擇恰當(dāng)?shù)姆答伩刂茀?shù)，以及了解這些參數(shù)與微生物代謝、菌體生長(zhǎng)、基質(zhì)利用以及產(chǎn)物形成之間的關(guān)系。根據(jù)這種關(guān)系，補(bǔ)料的聯(lián)機(jī)控制可通過(guò)攝氧率來(lái)執(zhí)行。根據(jù)攝氧率與糖耗速率之間的線性關(guān)系制定的加糖模型在加糖時(shí)發(fā)現(xiàn)，最佳 K 值應(yīng)為 。 例如，用連續(xù)培養(yǎng)方法測(cè)定了在不同比生長(zhǎng)速率下青霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)黃青霉的碳、氯、氧、磷、硫和乙酸鹽及菌最適生長(zhǎng)所需的各種基質(zhì)的補(bǔ)料速率。 固態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵主要是一些傳統(tǒng)發(fā)酵工藝。 發(fā) 酵過(guò)程中，一般都采用比較低的溫度，讓糖化作用和發(fā)酵作用同時(shí)進(jìn)行；即采用邊糖化邊發(fā)酵的工藝。糖化進(jìn)行緩慢，發(fā)酵也就緩慢，窖內(nèi)升溫慢些，酵母就不易衰老，發(fā)酵率就升高。酸度來(lái)自原料本身，曲和酒醅是最主要的。 （ 2）水分的控制 固體發(fā)酵中水份是微生物生長(zhǎng)的條件，適當(dāng)?shù)乃质橇己冒l(fā)酵的重要因素。 液態(tài)厭氣發(fā)酵對(duì)無(wú)菌要求較高，因此培養(yǎng)基必須經(jīng)過(guò)滅菌，對(duì)發(fā)酵容 器也要定期滅菌。 罐內(nèi)維持正壓，可防止外界空氣中雜菌的侵入，保證純種培養(yǎng)。攪拌轉(zhuǎn)速大小與發(fā)酵液的均勻性和氧在發(fā)酵液中的傳遞速率有關(guān)。它的大 小與氧的傳遞和其它控制參數(shù)有關(guān)。粘度的大小可表示相對(duì)菌體濃度。 2，基質(zhì)濃度 指發(fā)酵液中糖，氮，磷與重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度。 4，氧化還原電位 培養(yǎng)基氧化還原電位是影響微生物生長(zhǎng)及其生化活性的因素之一。從尾氣中 O2 和 CO2 濃度的含量可以算出產(chǎn)生菌的攝氧率、呼吸商和發(fā)酵罐的供氧能力。 三、生物參數(shù) 1，菌（絲）體濃度（生物量 biomass） 菌體濃度的大小和變化速度對(duì)生化反應(yīng)有影響，特別是對(duì)抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵，菌體濃度與培養(yǎng)液的粘度， DO 都