核酸提取及常見問題分析-免費(fèi)閱讀
【正文】 用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低 。 ? 減少起始樣品量 ， 確保裂解完全 、 徹底 ? 解決辦法 :重新抽提一次 ， 再沉淀 ， 溶解 。 RNA提取的通用方法 影響 RNA提取的因素 ? 材料 ： ? 新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料 ? 如若材料來源困難，且實驗需要一定的時間間隔。 ? 裂解變性 ： 異硫氰酸胍 （ 亞硫氫胍，巰基乙醇， N月桂肌氨酸等）。 ? 用多糖水解酶將多糖降解。 適用于純度要求高的實驗。 前言 第一部分： DNA提取方法簡介 第二部分： DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 第三部分： RNA提取方法簡介 第四部分： RNA提取及其 RTPCR常見 問題、原因分析及其對策 DNA提取的幾種方法 ? 基因組 DNA的提取 ? CTAB法 ? SDS法 ? 其它 DNA提取的幾種方法 ? 非基因組 DNA的提取 ? 質(zhì)粒 DNA的提取 ? 堿裂解法 ? 煮沸法 ? 線粒體、葉綠體 DNA的提取 ? 差速離心結(jié)合 SDS裂解法 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB法原理 （植物 DNA提取經(jīng)典方法） ? CTAB（ hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ pH ） NaCl SDS 終濃度 10 mM 20 mM 2% ? SDS法 DNA提取緩沖液 ? SDS法流程圖 （以動物組織為例） 動物組織 細(xì)胞裂解 上層溶液 組織勻漿 抽提 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ SDS法 基因組 DNA－其它方法 ? 物理方式 ：玻璃珠法、 超聲波法、研磨法、凍融法 ? 化學(xué)方式 ：異硫氰酸胍法、堿裂解法 ? 生物方式 ：酶法 ? 根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有： 基因組 DNA－其它方法 ? 吸附材料結(jié)合法： ? 根據(jù)核酸分離純化方式的不同有： ? 硅質(zhì)材料 ? 陰離子交換樹脂 ? 磁珠 高鹽低 pH值結(jié)合核酸，低鹽高 pH值洗脫。 ? 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。 對 策 原因 1. 實驗材料不佳或量少 2. 破壁或裂解不充分 3. 沉淀不完全 4. 洗滌時 DNA丟失 1. 盡量選用新鮮（幼嫩）的材料 2. 動植物要勻漿研磨充分； G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁 3. 高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加 PK的用量） 4. 低溫沉淀，延長沉淀時間 5. 加輔助物，促進(jìn)沉淀 6. 洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒 DNA提取常見問題 ?問題三： DNA提取量少。 ? 沉淀： 異丙醇、無水乙醇。 RNA降解 ? 冷凍樣品： ? 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍 ， 然后可以移至70℃ 冰箱保存 。 ? 設(shè)備限制： ? 測定 OD260 及 OD280 數(shù)值時 ， 要使 OD260 讀數(shù)在 之間 。 下游實驗效果不佳 ? RNA 降解 ? 抽提試劑的殘留 75% 乙醇洗滌 ? 樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 ? DNA 污染 使用 RNaseFree 的 DNase I 消化抽提 RNA RT常見問題分析和解決方案 問題一： 少量或沒有 RTPCR產(chǎn)物 RNA降解 分離無污染，高質(zhì)量的 RNA；防止 RNA降解
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