擬南芥基因克隆的策略與途徑-免費(fèi)閱讀
【正文】 目前共發(fā)現(xiàn)了3種類型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子：Tylcopia類，Ty3gypsy類和LINE(long interspersed nuclear Clements)類轉(zhuǎn)座子，前兩類是具有長末端重復(fù)的轉(zhuǎn)座子，LINE類轉(zhuǎn)座子沒有長末端重復(fù)。這一元件不僅可用于分析生物遺傳進(jìn)化上分子作用引起的一些現(xiàn)象，還為基因工程和分子生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具，可以在不了解基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和表達(dá)模式的情況下，分離克隆植物基因，即轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(transposon tagging)，又稱為轉(zhuǎn)座子示蹤法。現(xiàn)在最常用的方法是用含有目標(biāo)基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去篩選cDNA文庫，并查詢生物數(shù)據(jù)信息庫，待找出侯選基因后，把這些侯選基因進(jìn)行下列分析以確定目標(biāo)基因：（1）精確定位法檢查cDNA是否與目標(biāo)基因共分離；（2）檢查cDNA時空表達(dá)特點(diǎn)是否與表型一致；（3）測定cDNA序列，查詢數(shù)據(jù)庫，以了解該基因的功能；（4）篩選突變體文庫，找出DNA序列上的變化及與功能的關(guān)系；（5）進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，通過轉(zhuǎn)化突變體觀察突變體表型是否恢復(fù)正常或發(fā)生預(yù)期的表型變化。一般需要3000~4000個F2代植物個體（包括粗定位時的600個F2代植物個體）來精確地定位突變基因。在其生長過程中，我們可確定其表型，大約有150個個體被認(rèn)為是純合體（在隱性突變的情況下是純合突變體，在顯性突變的情況下是純合野生型）。作為作圖過程的第一步，突變體植株將和另外一個生態(tài)型（Col0或者Ler）的植株雜交。SSLP是基于PCR的分子標(biāo)記，在擬南芥基因組中有較多分布，而且是共顯性的，它的檢測非常直接，但是我們需要設(shè)計引物來檢測假定的SSLP標(biāo)記；對SNPs標(biāo)記的檢測也比較直接，它是擬南芥不同生態(tài)型之間基因組中的單個核苷酸的差別，這些差別的核苷酸通常位于非編碼區(qū)域（Peters等， 2003）。這和反向遺傳學(xué)（reverse genetics）的方法正好相反。本文就基因克隆的幾種常用方法介紹如下。基因(gene)是遺傳物質(zhì)的最基本單位,也是所有生命活動的基礎(chǔ)。近幾年來隨著擬南芥基因組測序工作的完成，各種分子標(biāo)記的日趨豐富和各種數(shù)據(jù)庫的完善，在擬南芥中克隆一個基因所需要的努力已經(jīng)大大減少了（圖1）。實(shí)質(zhì)上，分子標(biāo)記是一個特異的DNA片段或能夠檢出的等位基因，對其有效地利用即可達(dá)到圖位克隆基因之目的。2 圖位克隆的一般過程因?yàn)橛辛藬M南芥的基因組序列和高密度的遺傳標(biāo)記，圖位克隆過程就變得相對直接。最好通過對一些標(biāo)記的分析來確認(rèn)F1代植物是雜合體，而且在雜交過程中我們沒有犯錯誤。下一步我們將播種一個更大的F2代群體用于突變基因的精細(xì)定位（fineresolution mapping，圖2）。一種有效的方法是設(shè)計PCR引物來擴(kuò)增覆蓋這40 Kb的多個重疊的500 bp的片段。DbEST，database EST 表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫。第一類轉(zhuǎn)座子可以通過DNA復(fù)制或直接切除兩種方式獲得可移片段，重新插入基因組DNA中。目前已經(jīng)克隆的
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