【正文】 iPCR 反應一般只要有特異條帶就是目的條帶了。 內蒙古 大學本科畢業(yè) 論文 (設計 ) 克隆基因片段序列的測定 通過菌落 PCR鑒定重組質粒，將其菌斑擴大培養(yǎng)， 5mlLB 培養(yǎng)基搖菌 200rpm，1618h。 （ 3） 加入 10μl連接好的 pMD18TNHX 及 pMD18TAct 混合溶液，輕輕震蕩后放置到冰上 30min。 （ 5） 將制備管置回 2ml 離心管，加 500μ lBuffer Wl,12021 轉 離心 305，棄濾液 。 大腸桿菌 DH5α 超級感受態(tài)細胞的制備（ TB 法） （ 1） 液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌 ,在 LB 平板上劃線 ,37 度過夜至長出單菌落 ， （ 2） 挑直徑 13 毫米的單菌落 ,接種到 250 毫升錐形瓶 SOB 培養(yǎng) 基 ， 培養(yǎng)基量不可再多 ,會影響效率 ， （ 3） 在 18 度 150250RPM 培養(yǎng) 1950 小時沒有冷卻搖床的可在室溫 , 但不可高于 37 度 ， OD600 約 時停止培養(yǎng) , 放在冰水中冷卻 10 分鐘 內蒙古 大學本科畢業(yè) 論文 (設計 ) （ 4） 4 度 ,4000 rpm離心 10 分鐘 , 回收菌體 ， （ 5） 去掉上清后 , 用 1/3 體積的冰冷 TB 溶液懸浮 , 預 冷 10 分鐘 ， 再次離心回收菌體 ， （ 6） 用 1/ 體積的 TB 懸浮 , 添加最終濃度為 7%的 DMSO, 再冷卻 10 分鐘 ， （ 7） 分裝 ， 70℃ 超低溫儲存。 白刺總 RNA 的提取及鑒定 改良的 CTAB 法提取植物總的 RNA【 33】 （ 1） 65℃ 預熱 10ml2%CTAB 提取緩沖液（加入 %β 巰基乙醇 ）； （ 2）液氮 中 研磨 1g 新鮮 植物組織； （ 3） 在研缽中加入預熱的 CTAB 提取液，解凍后用剪寬了的槍頭移入 10ml 離心管中，干式恒溫器中 65℃孵育 15min； （ 4）加入等體積的氯仿 /異戊醇 （ 24： 1） 并渦旋混 勻 10min， 6000 rpm離心 10min； （ 5）將上清轉移至一新 離心管中， 重復抽提一次 ； （ 6）將上清轉移至一新 離心管 中，加入 1/4 體積 LiCl,4176。 實驗使用試劑盒 （ 1） TaKaRa RNA PCRKit（ AMV） （ 2） AXxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒 實驗用引物 實驗用 引物由 invitrogen 公司合成 DegNHXF： 5’ CCICCIATHATHTTYAAYGCIGG 3’ PPIIFNAG DegNHXR： 5’ RTAIGCCATIARCATCAT 3’ MMLMAY Deg Act1： 5’ ATGGTIAARGCIGGITTYGC3’ MVKAGFA Deg Act2： 5’ CCACATYTGYTGRAAIGTIS3’ STFMW 3’RACE 特異性引物 NHXGSPF（ 1） ： 5’ATTTTGCCAGGCACTCAA3’ NHXGSPF（ 2） ： 5’TGCTTGGCGTCATTACTGGA3’ iPCR 特異性引物 NHXR： 5’TCACCTGGAATCCCGCAT3’ NHXF： 5’ ATTTGAACACCAGCTCGGCTTT3’ 載體及菌株 （ 1） pMD18T Vector （ TaKaRa） ，可利用 M13RV 引物和 M13M4 引物進行測序，同時含有編碼β 半乳糖苷酶（ lacZ）α 肽 的基因，可以根據α互補原理通過插入失活顯色對重組子進行篩選。 1)℃ ,光照強度 36~40μ mol 理想的內參基因應該滿足 :①不存在假基因，以避免基因組 DNA 的擴增。白刺屬植物具有很高的開發(fā)利用價值，如營養(yǎng)保健價值、藥用價值、生態(tài)價值、經濟價值等。為了較深入研究 NHX1 基因的作用，國內外研究員做了很多的探討。 Junsheng Zhao 等 將 AtNHX1 轉到 tall fescue (Festuca arundinacea)中，過量表達 AtNHX1 基因可以顯著提高轉基因植物耐鹽性， 200mM NaCl 溶液中，顯出比對照組更強的耐性。 ABI1 可以調 控 NHX1 等基因的表達， ABI2 則可以通過抑制 SOS2的激酶活性或 SOS2 底物的活性來負調控離子均衡。 另外， Yamaguchi 等 【 8】 異源表達酵母細胞的實驗表明 AtCaM15(類似鈣調素的蛋白 ) 定位 于 液泡 腔內 的 AtNHX1 C 末端 ，依賴于 Ca2+和 pH 值 ，隨 pH 值的升高降低與 AtNHX1 的連接，同時改變轉運體對 Na+/H+的選擇性。 AtNHX1 C 末端的缺失使 Na+/H+選擇比率增加一倍，證實 C 末端的調節(jié)功能。AtNHX1 由 9 個跨膜區(qū)域和 1 個親水的 C 末端結構域組成，其中 3 個推測的疏水跨膜區(qū) TM TM TM6 看上去與膜相連，實際上并沒有跨過液泡膜。它們的分配方式相似， AtNHX14 和 OsNHX14構成 I 類 ,AtNHX56 和 OsNHX5 構成 II 類。液泡膜上存在兩類質子泵，分別為液泡膜 H+ATPase 和H+PPase，他們分別通過水解 ATP 和焦磷酸（ PPi）產生能量將 H+進行定向運輸，在液泡膜兩側形成質子梯度 【 3】 ，提供能量驅動液泡膜上 Na+/H+逆向轉運體，從而使 Na+進行跨膜運輸，被動進入液泡。自然界中造成鹽脅迫的鹽分主要是 NaCl、 NaHCO Na2CO Na2SO4，通常這些鹽同時存在，稱為鹽堿土。液泡膜上的 Na+/H+逆向 轉運 蛋白是將胞質內的 Na+逆 Na+濃度梯度運送到液泡膜中進而將 Na+區(qū)域化集中。植物鹽害可分為原初鹽害和次生鹽害，原初鹽害是指鹽離子本身對植物產生的傷害，即離子脅迫導致的傷害，包括破壞質膜的選擇透過性和干擾植物的各種代謝過程；次生鹽害則包括由土壤鹽分過多引起的滲透脅迫和由離子間的競爭引起的營養(yǎng)虧損。 小果白刺的 肌 動蛋白基因的克隆 為 今后 研究 NHX 等 白刺 屬植物的 基因表達奠定基礎。 植物的耐鹽機制 不同植物對鹽脅迫的適應方式不同，或者通過減少鹽分在體內的積累逃避鹽害，或者通過自身生理或代謝過程來適應或忍受細胞內的高鹽環(huán)境。相對而言， II 類的成員存在于植物內膜囊泡上，同時也包括定位于動物和細菌中多種內體上的同源蛋白。前者對氨氯吡嗪脒（ amiloride）及其衍生物敏感，是負責轉運的區(qū)域，由 912 個跨膜結構域組成。另外， AtNHX1 的 TM3 與 TM TM6可能分別構成了胞質和液泡中結合離子的結構，它們的方向決定離子運動的方向 。利用酵母異源表達系統(tǒng)進行末端缺失實驗中， N 末端缺失 17 個氨基酸引起 Na+/H+轉運活性輕微降低和 K+/H+轉運活性的少量增加。 NaCl 對 AtNHX1 的上調程度在 abi11(ABA 不敏感突變體 )、 aba21 和 aba31(ABA 缺乏突變體 )中被減少，但在突變體 abi2 sos1(質膜 Na+/H+逆向轉運蛋白基因 SOS1 突變體 )、 sos2(蛋白激酶基因 SOS2 突變體 )和sos3(鈣結合蛋白基因 SOS3 突變體 )并無類似情況發(fā)生。而Gaxiola 等 【 16】 將 AtNHX1 在對 NaCl 敏感的酵母 nhx1 突變體菌株中進行異源表達，結果表明 AtNHX1 能抑制 nhx1 突變體的敏感表型， AtNHX1 的某些功能和酵母NHX1 是等價的， AtNHX1 恢復酵母 nhx1 突變體 Na+耐性的功能與酵母內源的ScNHX1 功能相似。這些結果表明，提高液泡膜 Na+/H+逆向轉運蛋白轉錄水平，能使小麥的耐鹽性及在鹽土壤中谷粒的產量提高。 目前在GenBank 上登錄的 Na+/H+逆向轉運蛋白 核酸序列達到 500 多個。本研究中我選擇了生于輕度鹽漬化低地、湖盆邊緣、干河床邊，可作為優(yōu)勢種并形成群落的小果白刺。 Actin 基因是管家基因之一，在各種不同器官上恒定表達，因而它可以用作分子內標來研究其它基因的表達差異。 DEPC 水定容至 1L。 根據 GenBank 公布的擬南芥、玉米、苜蓿、鹽芥等植物的 Na+/H+逆向轉運蛋白的氨基酸序列， ClustalX 軟件進行多 序列同源性比對。 Positive Control RNA 1 μl Total 10μl /Sample （ 2） 反應條件 30℃ 10min 42℃ 30min 1 Cycle 99℃ 5min 4℃ 5min 白刺 Na+/H+逆向轉運蛋白基因 cDNA 片段的克隆 PCR 反應體系： 10X PCR Buffer dNTP（各 ） 2μL degNHXF（ 50μm） 1μL degNHXR（ 50μm） 1μL cDNA 2μL rTaq DNA polymerase dd H2O total 25μL 按以下條件進行 PCR 反應 94℃ 2min 94℃ 30s 45℃ 1min 35 cycle 72℃ 30s 內蒙古 大學本科畢業(yè) 論文 (設計 ) 72℃ 5min PCR 結束后，取 5ｕ lPCR 產物 1%瓊脂糖凝膠電泳， 120V電壓，泳動 30min 后，經 溴化乙錠染色 10min，凝膠成像系統(tǒng)照相檢測是否擴增出目的條帶（ 500bp）。當分離的 DNA 片段小于 400bp 時，加入 1 個凝膠體積的異丙醇 。 12021 轉離心 1 min 洗脫 DNA。然后 從酒精中取出玻璃棒，在火上點燃，稍等片刻， 待其冷卻之后，迅速將菌液涂布均勻。 PCR 反應體系： 10X PCR Buffer dNTP（各 ） 2μL NHXGSPF（ 1） （ 10μ m） 1μL M13M4（ 10μ m） 1μL PCR 產物 rTaq DNA polymerase dd H2O total 25μL 按以下條件進行 PCR 反應 94℃ 2min 94℃ 30s 50℃ 45s 35 cycle 72℃ 1min 72℃ 5min 反應結束后取 5μL電泳，檢測有無目的條帶。 、 酶切反應條件 在 離心管中加入下列試劑： 基因組 DNA 3ｕ l 10 buffer 2ｕ l ScaI/Aor51HI 1ｕ l ddH2O 14ｕ l total 20ｕ l 37 酶切過夜 ，取 3ｕ l酶切產物電泳鑒定。 實驗流程如下圖： 圖 TaKaRa 公司的 RNA PCR Kit（ AMV） 3’RACE 反應圖解 、 特異引物的設計 根據克隆得到的 516bp 的 cDNA 片段，在 靠近 3’端設計二個正向特異性引物（ NHXGSPF（ 1） ， NHXGSPF（ 2） ），引物序列為： NHXGSPF（ 1） ： 5’ATTTTGCCAGGCACTCAA3’ NHXGSPF（ 2） ： 5’TGCTTGGCGTCATTACTGGA3’ 下游為 試劑盒提供 M13M4 引物， 引物序列為 M4： 5’GTAAAACGACGGCCAGT3’ 、 3’RACE 反應 內蒙古 大學本科畢業(yè) 論文 (設計 ) cDNA 第一鏈的獲得如前文所述，以 cDNA 為模板進行剿式 PCR，擴增 cDNA 3’末端的未知序列。 （ 6） 3000rpm短暫離心，棄上清，加入 40μl 的 2%的 Xgal， 7μl 的 20% IPTG 混勻。 （ 7） 將制備管置回 2ml 離心管中， 12021 轉離心 1 min。 （ 2） 加入 3 個凝膠體積的 BufferDE