【正文】 Ham’s F12與DMEM 等體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結(jié)合的培養(yǎng)基；FreeStyle CHO Expression Medium、CD CHO Medium、CD OptiCHO Medium是CDM，專用于CHO細(xì)胞表達(dá)分泌外源蛋白，均為非動(dòng)物源性產(chǎn)品，用有生物活性的合成化學(xué)物代替天然的動(dòng)物源性物質(zhì)，所有組分均有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)。CHO表達(dá)亞單位疫苗有諸多優(yōu)勢(shì)，但用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細(xì)胞成本高，在一定程度上限制了CHO細(xì)胞表達(dá)亞單位疫苗的發(fā)展。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法適用性廣，重復(fù)性好，作用溫和，操作簡(jiǎn)便。物理方法有電穿孔、顯微注射和基因槍，如電穿孔法：利用特殊實(shí)驗(yàn)裝置產(chǎn)生高壓電，使細(xì)胞膜上瞬間穿開小孔，胞外溶液中的質(zhì)粒DNA隨之進(jìn)入胞漿。 因此，CHO細(xì)胞株成為表達(dá)重組蛋白HSV I gB的理想宿主。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，它具有表達(dá)水平高、操作簡(jiǎn)單、周期短、易于大規(guī)模高密度培養(yǎng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于全抗體和糖蛋白類生物藥物來(lái)說(shuō)，表達(dá)產(chǎn)物多肽鏈的折疊、二硫鍵的形成、糖基化的有無(wú)以及糖基化的類型常常影響表達(dá)產(chǎn)物的合成分泌、生物活性、體內(nèi)穩(wěn)定性以及免疫原性等特性[61]。（2）第二步，方案Ⅰ: HiTrap Phenyl FF（1ml）離子交換層析，取第一步層析洗脫的活性組份10ml上柱純化。對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS–PAGE電泳和Western blotting分析（圖10），結(jié)果顯示重組蛋白純化效果較好，灰度分析顯示其純度為95%，無(wú)其他雜帶，純化后蛋白濃度明顯大于純化前。而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pMCE5的細(xì)胞上清無(wú)蛋白帶出現(xiàn)。 五、重組蛋白的定量檢測(cè)為檢測(cè)純化后蛋白濃度，采用Bradford分光光度法測(cè)定蛋白含量。第一步離子交換層析。 mL/min的流速進(jìn)行漂洗。 mL/min的流速進(jìn)行漂洗。~2105/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種四孔， DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)基于37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，用PBS洗1~2次，四孔細(xì)胞株分別加入600 μL 以上四種無(wú)血清表達(dá)培養(yǎng)基，并于24h、48h、72h、96h、168h各取樣5μL做Western blotting檢測(cè)（同方法三），比較分析差異。L，混勻后均勻滴加在膜硝酸纖維素膜上，避光反應(yīng)5 min，稍瀝干，放入壓片盒中。L加入EP管，再加入等體積的2加樣緩沖液（100 mmol/L Tris–HCl（），4%SDS， % 溴酚藍(lán)，20%甘油，用前加5%β–二巰基乙醇），混勻后水浴煮沸5 min，4℃，12000 rpm離心2 min。L混勻后灌入玻璃板間，H2O壓平分離膠，室溫放置，待其聚合后灌制5%濃縮膠。與此同時(shí)，給24孔板中待轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞換上500μL新鮮無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基。材料與方法一、 實(shí)驗(yàn)材料（一） 質(zhì)粒和細(xì)胞重組真核表達(dá)質(zhì)粒HSV I gBt pMCE5由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。這種基因改造從分子機(jī)理水平上來(lái)說(shuō)是針對(duì)蛋白翻譯水平的調(diào)整，使蛋白的翻譯順利進(jìn)行一提高蛋白的表達(dá)水平。稀有密碼子要經(jīng)過(guò)多次的識(shí)別才能找到正確的tRNA[58]，影響編碼速度。目前表位預(yù)測(cè)的方法主要有基于序列、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以及基于分子模擬的表位預(yù)測(cè)方法等[56]。HSV I gB由基因UL27編碼，含904個(gè)氨基酸，包括一個(gè)696個(gè)氨基酸的外功能區(qū)，一個(gè)69個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)和一個(gè)109個(gè)氨基酸的羧末端。其中7泳道條帶較亮，9泳道條帶較淡（圖3）。二、優(yōu)化合成HSV I gB蛋白胞外區(qū)基因序列優(yōu)化HSV I gB蛋白N端469個(gè)氨基酸的基因序列，利用偏愛(ài)密碼子，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)合能最小化，調(diào)整GC含量等。L重組DNA 181。L上述試劑加入PCR反應(yīng)管中混勻后稍離心，上層加50181。L，PCR反應(yīng)條件如下：反應(yīng)成分用量PrimeSTAR HS（Premix） 181。（轉(zhuǎn)化反應(yīng)中同時(shí)設(shè)一空白宿主菌作為對(duì)照板，若此平板中無(wú)菌落生長(zhǎng)則說(shuō)明無(wú)污染）重組質(zhì)粒的鑒定[52]（1）、引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)合成的全新HSV I gB基因片段設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以引物設(shè)計(jì)常見(jiàn)原則如：引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間；引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃；引物3162。（2）、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：① mL eppendorf管中加入200 181。L HSV I gB DNA (EcoR I + Not I) 181。L Rinse B 加入Spin Column，12000 rpm離心30 s，棄濾液。）（7）向上述膠塊融化液中加入DR– I Buffer量的1/2體積量的DR–II Buffer，均勻混合。（切膠時(shí)注意不要將DNA長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。LDNA（HSV I gB/ pMCE5） 181。（把滅菌水或Elution Buffer加熱至60℃使用時(shí)有利于提高洗脫效率。（7）將上述操作5的中溶液移至Spin Column中，12000 rpm離心1 min，棄濾液。（2）用250 181。（三） 菌株與質(zhì)粒載體大腸桿菌Escherichia coli DH5α、真核表達(dá)載體pMCE5由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞上清的純化與鑒定，獲得高純度重組gBt蛋白。也有實(shí)驗(yàn)表明兔接種分泌形式的gB，對(duì)由HSV I感染引起的角膜炎，腦膜炎和死亡具有明顯保護(hù)作用[48]。并且病毒糖蛋白與病毒的致病作用以及誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)等密切相關(guān)[43]。目前研究較多的是腺病毒載體，其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于基因組內(nèi)有2個(gè)能插入外源基因的功能區(qū)域，有研究指出表達(dá)HSV gB的重組腺病毒能引起較好的體液免疫應(yīng)答，在自然呼吸道感染的情況下能產(chǎn)生好的粘膜免疫應(yīng)答[34]。許多研究采用HSV包膜糖蛋白作為免疫原來(lái)制備亞單位疫苗。這類疫苗免疫力強(qiáng)、作用時(shí)間長(zhǎng)，但安全性是一個(gè)問(wèn)題。盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物應(yīng)用能縮短病毒感染的病程，促進(jìn)皮損愈合、縮短排毒時(shí)間、減輕傳染性，防止并發(fā)癥，并且對(duì)治療復(fù)發(fā)性感染取得一些效果，但這些抗病毒藥物不能有效預(yù)防皰疹病毒原發(fā)感染及完全控制皰疹病毒潛伏感染和復(fù)發(fā)性感染[1820]。HSV的感染在全世界都非常普遍。同時(shí)，HSV I引起的生殖性皰疹也日益增多。HSV為有包膜的DNA 病毒，屬皰疹病毒科α亞科，由外膜、核衣殼、皮質(zhì)層和核酸組成。HSV有二個(gè)血清型，即HSV I型和HSV II型，迄今為止已測(cè)定了HSV I和HSV II基因組的全部序列，序列分析顯示二者在核苷酸序列、框架結(jié)構(gòu)、編碼蛋白質(zhì)功能上存在較大同源性，型間有共同抗原，也有特異性抗原。其特點(diǎn)是每次復(fù)發(fā)病變往往發(fā)生于同一部位。在美國(guó)總?cè)丝谥?，?0年HSV II血清流行率增加了1/3，達(dá)23%[14]。滅活疫苗既可用于預(yù)防HSV感染，也可用于治療HSV感染。發(fā)現(xiàn)含全長(zhǎng)基因片段的質(zhì)粒能引起強(qiáng)的細(xì)胞免疫，但僅能引起較低的抗體水平；含部分基因片段的質(zhì)粒能引起高效價(jià)的抗體水平，但只有很弱的細(xì)胞免疫[27]。另一種由Glaxo Smith Kline公司開發(fā)的gD2聯(lián)合佐劑AS04，在兩個(gè)III期的臨床試驗(yàn)中能對(duì)HSV血清陰性的婦女提供有效的保護(hù)（有效率分別為73%和74%），而對(duì)血清反應(yīng)陽(yáng)性的婦女則效果有限（有效率分別為46%和39%）[33]。廣州軍區(qū)總院[4142]，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院等單位的初步研究結(jié)果顯示HSV II核酸疫苗可刺激小鼠產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但在人體中的安全性問(wèn)題尚難確定。它是皰疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株間差異較小，且與所有的皰疹類病毒亞群有較大的同源性[47]。獲得的高表達(dá)重組蛋白經(jīng)純化、鑒定后，免疫小鼠制備抗血清，并對(duì)其抗原性和免疫活性進(jìn)行檢測(cè)。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析工具對(duì)HSV I gB抗原表位進(jìn)行分析，篩選出抗原表位較富集的胞外區(qū)片段；優(yōu)化基因序列，選用真核細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子，重新設(shè)計(jì)合成基因gBt，并克隆至pMCE5載體中，構(gòu)建適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的真核載體。參考OptimumGeneTM軟件分析數(shù)據(jù)，采用最佳密碼子，去除去穩(wěn)定序列，減少了AT和GC重復(fù)，使mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并且提高了目的基因中G+C的含量，消除富含AT的序列區(qū)段，避免翻譯的提前終止等。L預(yù)冷的Solution III，輕輕顛倒試管混勻4–6次，有沉淀生成，室溫靜置2 min。（10）重復(fù)操作步驟9。L反應(yīng)體系進(jìn)行，并選用兩種酶切割效率都較高的緩沖液。具體步驟如下：（1）使用TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，對(duì)目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。L 進(jìn)行計(jì)算。）（10）將500 181。）（14）12000 rpm離心1 min洗脫DNA，收集于－20℃保存?zhèn)溆?。~，將菌液置冰上冷卻后，于4℃以4000 rpm離心10 min沉淀細(xì)菌。④轉(zhuǎn)化液混勻后取200 181。③于4℃以12000 rpm離心5 min，上清即為PCR鑒定用模板。LDNA（模板） 181。（3）、重組質(zhì)粒的酶切鑒定：①將PCR鑒定的陽(yáng)性克隆菌培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定目的基因片段是否插入載體酶切位點(diǎn)之間。②%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）電泳鑒定（80 V，40 min），凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。重新合成的全新基因序列HSV I gBt（圖2），更易于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)和純化。經(jīng)測(cè)序，擴(kuò)增出的DNA序列與設(shè)計(jì)合成的HSV I gBt基因序列進(jìn)行比對(duì)，100%匹配且目的基因片段插入載體后其翻譯閱讀框架正確?？乖砦皇菦Q定蛋白質(zhì)抗原性的特殊化學(xué)基團(tuán)，也與生物機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。實(shí)際上用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物（包括大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞）都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛(ài)，即在不同宿主中同一氨基酸對(duì)應(yīng)的不同密碼子之中也有使用頻率的高低之分。因此，制備重組蛋白時(shí)，要獲得重組蛋白的高水平表達(dá)，應(yīng)在不改變氨基酸組成的前提下，對(duì)目的基因進(jìn)行分析處理。用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法，將重組質(zhì)粒HSV I gBt pMCE5導(dǎo)入CHO細(xì)胞中，通過(guò)G418篩選獲得轉(zhuǎn)入目的基因的陽(yáng)性細(xì)胞克隆。具體步驟如下：稀釋質(zhì)粒：分別以50 μL無(wú)血清DMEM/ μg~ μg的重組質(zhì)粒DNA和空載體DNA。（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制：12%分離膠：H2O mL30%丙烯酰胺 mL Tris pH mL10%過(guò)硫酸銨 181。LTEMED 181。（6）一抗孵育：小鼠抗His單抗（1 mg/mL）1：5000稀釋于封閉液中，與硝酸纖維素膜室溫孵育2 h，TBST洗膜310 min。Dot blotting檢測(cè)選取的單克隆細(xì)胞在96孔板中表達(dá)72 h后，每個(gè)克隆孔取5 μL表達(dá)上清液，滴加在硝酸纖維素膜上，室溫放置30 min后置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉1 h，小鼠抗His單抗（1 mg/mL）1：5000稀釋于封閉液中，室溫孵育2 h，TBST洗膜310 min，羊抗小鼠IgG–HRP 1：5000稀釋于封閉液中，室溫孵育1 h，TBST洗膜310 min，稍瀝干后化學(xué)發(fā)光底物液均勻滴加在膜硝酸纖維素膜上，避光反應(yīng)5 min，稍瀝干，放入暗盒于暗室中壓片，根據(jù)熒光強(qiáng)度決定曝光時(shí)間。②將Ni Sepharose 6 FF凝膠3mL裝填到層析柱上連接層析儀器，用5倍柱體積(CV) 的結(jié)合緩沖液(1PBS, mol/L NaCl。細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，%胰蛋白酶消化吹散后接種至T75cm2方瓶中DMEM/F12 + 10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，用PBS洗3~4次，換無(wú)血清培養(yǎng)基CD CHO Medium+100L–Glutamine（終濃度為8 mM/mL）培養(yǎng)72h收集細(xì)胞上清1000 mL。細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，%胰蛋白酶消化吹散后接種至T75cm2方瓶中DMEM/F12 + 10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。SDS–PAGE蛋白電泳和Western blotting分析純化的目的蛋白，方法同前。結(jié)果一、穩(wěn)定高效表達(dá)重組蛋白的CHO細(xì)胞株篩選CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSV I gBt pMCE5后，經(jīng)G418 持續(xù)篩選，未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在含G418 的培養(yǎng)液中，8 d 內(nèi)全部離壁死亡，14 d 時(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞絕大部分死亡，但可見(jiàn)散在生長(zhǎng)的G418 抗性細(xì)胞克隆。圖6：第一次克隆化Dot bloting篩選穩(wěn)定高表達(dá)HSV I gB的細(xì)胞株 S：Histag蛋白標(biāo)準(zhǔn)品圖7：第二次克隆化Dot bloting篩選穩(wěn)定高表達(dá)HSV I gB的細(xì)胞株 S：Histag蛋白標(biāo)準(zhǔn)品圖8：第三次克隆化Dot bloting篩選穩(wěn)定高表達(dá)HSV I gB的細(xì)胞株 表1：GelPRO ANALYZER凝膠定量分析軟件分析細(xì)胞株IOD值標(biāo)本編號(hào)1D121F52A82D13C2IOD注：細(xì)胞株分別為HSV I gB1D1 HSV I gB1FHSV I gB2AHSV I gB2DHSV I gB3C2三、四種無(wú)血清培養(yǎng)基中重組蛋白的表達(dá)差異將HSV I gB1D122A83C2細(xì)胞株分別在四種無(wú)血清培養(yǎng)基：DEME/F12 Medium、FreeStyle CHO Expression Medium、CD CHO Medium、CD OptiCHO Medium中培養(yǎng)表達(dá)（四種均含有終濃度為8 mM/L L–Glutamine），并于培養(yǎng)的24h、48h、72h、96h、168h各取樣5μL，Western blotting檢測(cè)，方法同前，比較分析表達(dá)量間差異及高量表達(dá)時(shí)間差異（圖9A、B），確定無(wú)血清培養(yǎng)基CD CHO Medium培養(yǎng)72h，為獲得高表達(dá)蛋白的最優(yōu)選擇?；叶确治鲲@示， mol/L NaCl洗脫組分目的蛋白純度為15%， mol/L ~ mol/L NaCl洗脫組分目的蛋白純度為30%， mol/LNaCl， mol/L ~ mol/L NaCl洗脫目的蛋白效果更好。將三種方法純化獲得的目的蛋白溶液，各取10μL原液