【正文】 染及完全控制皰疹病毒潛伏感染和復發(fā)性感染[1820]。滅活的全病毒疫苗是通過加熱、紫外輻射等物理、化學方法將接種在雞胚或細胞中的HSV病毒滅活并經過一系列純化制備成的。這類疫苗免疫力強、作用時間長，但安全性是一個問題。FHo J 用包含HSV II gD全長基因以及刪除部分基因的質粒作疫苗來免疫小鼠。許多研究采用HSV包膜糖蛋白作為免疫原來制備亞單位疫苗。在臨床試驗中，由Chiron公司研發(fā)的gB2/gD2聯(lián)合疫苗配伍MF59佐劑在人類中具有高度的免疫原性，但在III期臨床試驗中卻未能保護受試者抵抗HSV II的感染[3132]。目前研究較多的是腺病毒載體，其獨特優(yōu)勢在于基因組內有2個能插入外源基因的功能區(qū)域，有研究指出表達HSV gB的重組腺病毒能引起較好的體液免疫應答，在自然呼吸道感染的情況下能產生好的粘膜免疫應答[34]。國內對HSV疫苗的研究主要集中在核酸疫苗的探索。并且病毒糖蛋白與病毒的致病作用以及誘導宿主的免疫反應等密切相關[43]。gB由基因UL27編碼，包括696個氨基酸的胞外功能區(qū)，69個氨基酸的跨膜區(qū)和109個氨基酸的胞內區(qū)。也有實驗表明兔接種分泌形式的gB，對由HSV I感染引起的角膜炎，腦膜炎和死亡具有明顯保護作用[48]。通過對HSV I Patton株gB氨基酸序列分析，篩選含強抗原決定簇較聚集的胞外區(qū)片段，優(yōu)化基因序列，化學合成全新的基因片段gBt，克隆至真核細胞表達載體，建立重組gBt蛋白哺乳動物細胞穩(wěn)定表達細胞系，并優(yōu)化細胞培養(yǎng)方案。細胞上清的純化與鑒定，獲得高純度重組gBt蛋白。因此，蛋白質抗原表位分析和基因優(yōu)化設計的原則是研制亞單位疫苗的重要線索和依據(jù)。（三） 菌株與質粒載體大腸桿菌Escherichia coli DH5α、真核表達載體pMCE5由本實驗室保存。（二） 化學合成基因的設計原則為達到融合蛋白的高水平表達，優(yōu)化基因序列，重新設計合成目的基因。（2）用250 181。（4）加入400 181。（7）將上述操作5的中溶液移至Spin Column中，12000 rpm離心1 min，棄濾液。L 的Rinse B 加入Spin Column中，12000 rpm離心30 s，棄濾液。（把滅菌水或Elution Buffer加熱至60℃使用時有利于提高洗脫效率。酶切反應在80 181。LDNA（HSV I gB/ pMCE5） 181。L混勻后在37℃（水浴或溫箱）反應3 h后取出，采用TaKaRa公司的DNA膠回收試劑盒（TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit ）%瓊脂糖凝膠中回收酶切后的目的基因和質粒載體DNA片段。（切膠時注意不要將DNA長時間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。計算膠塊體積時，以1 mg=1 181。）（7）向上述膠塊融化液中加入DR– I Buffer量的1/2體積量的DR–II Buffer，均勻混合。（如將濾液再加入Spin Column中離心一次，可以提高DNA的回收率。L Rinse B 加入Spin Column，12000 rpm離心30 s，棄濾液。（把滅菌水或Elution Buffer加熱至60℃使用時有利于提高洗脫效率。L HSV I gB DNA (EcoR I + Not I) 181。②取過夜培養(yǎng)物按1：50稀釋比例接種至50 mL新鮮的LB培養(yǎng)液中，于37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2~3 h。（2）、重組質粒的轉化：① mL eppendorf管中加入200 181。③加入1 mL預溫的LB培養(yǎng)液，混勻后于37℃，100 rpm搖床培養(yǎng)1h。（轉化反應中同時設一空白宿主菌作為對照板，若此平板中無菌落生長則說明無污染）重組質粒的鑒定[52]（1）、引物的設計與合成根據(jù)合成的全新HSV I gB基因片段設計一對引物，以引物設計常見原則如：引物長度一般在15~30堿基之間；引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃；引物3162。L ddH2O重懸菌體沉淀，沸水浴5 min后置冰上。L，PCR反應條件如下：反應成分用量PrimeSTAR HS（Premix） 181。L） 181。L上述試劑加入PCR反應管中混勻后稍離心，上層加50181。L，%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）電泳鑒定（80 V，40 min），凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結果。L重組DNA 181。L混勻后在37℃（水浴或溫箱）反應3 h后取出。二、優(yōu)化合成HSV I gB蛋白胞外區(qū)基因序列優(yōu)化HSV I gB蛋白N端469個氨基酸的基因序列，利用偏愛密碼子，RNA二級結構結合能最小化，調整GC含量等。端增加了Not I酶切位點及終止密碼子，使基因片段易于克隆至真核表達載體pMCE5的EcoR I和Not I酶切位點之間。其中7泳道條帶較亮，9泳道條帶較淡（圖3）。圖4重組質粒HSV I gBt pMCE5的酶切鑒定1：DNA marker（DL 2000）2：重組質粒HSV I gBt pMCE5雙酶切（EcoR I+Not I產物）DNA序列測定挑取PCR鑒定6號陽性重組子，提取質粒后進行DNA序列測定（南京金斯瑞公司）。HSV I gB由基因UL27編碼，含904個氨基酸，包括一個696個氨基酸的外功能區(qū)，一個69個氨基酸的跨膜區(qū)和一個109個氨基酸的羧末端。本研究選用HSV I gB作為研究對象，為HSV I單位疫苗的研制提供候選疫苗。目前表位預測的方法主要有基于序列、人工神經網絡以及基于分子模擬的表位預測方法等[56]。本研究應用生物信息學方法，基于HSV I gB全序列，并考慮有效表位肽的覆蓋范圍，分析后選用HSV I gB蛋白胞外片段N末端469個氨基酸片段為研究對象。稀有密碼子要經過多次的識別才能找到正確的tRNA[58]，影響編碼速度。Carol A Scorer[60]在表達HIV包膜糖蛋白gp120時，這個信號造成提前終止。這種基因改造從分子機理水平上來說是針對蛋白翻譯水平的調整，使蛋白的翻譯順利進行一提高蛋白的表達水平。大多數(shù)藥用蛋白是糖蛋白，中國倉鼠卵巢細胞 (Chinese hamster ovary cell,CHO cell) 是目前重組糖基蛋白生產的首選體系。材料與方法一、 實驗材料（一） 質粒和細胞重組真核表達質粒HSV I gBt pMCE5由本實驗室構建。二、 重組表達質粒HSV I gBt pMCE5轉染CHO細胞~2105/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)，當細胞融合度達到90%時，以HSV I gBt pMCE5重組表達質粒轉染CHO細胞，同時設空載體pMCE5轉染的對照和不轉染的CHO細胞對照。與此同時，給24孔板中待轉染的CHO細胞換上500μL新鮮無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。 重組蛋白HSV I gB的鑒定收集陽性細胞克隆培養(yǎng)，消化傳代后，待細胞融合度達到90%時，換新鮮DMEM/F12 + 10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，收集細胞上清，4℃，8000 rpm離心20 min，取樣做Western blotting檢測，剩余上清－20℃凍存?zhèn)溆?。L混勻后灌入玻璃板間，H2O壓平分離膠，室溫放置，待其聚合后灌制5%濃縮膠。L10%SDS 181。L加入EP管，再加入等體積的2加樣緩沖液（100 mmol/L Tris–HCl（），4%SDS， % 溴酚藍，20%甘油，用前加5%β–二巰基乙醇），混勻后水浴煮沸5 min，4℃，12000 rpm離心2 min。（5）封閉：取出硝酸纖維素膜，置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉1 h。L，混勻后均勻滴加在膜硝酸纖維素膜上，避光反應5 min，稍瀝干，放入壓片盒中。連續(xù)進行多次克隆化，直至所有的單克隆孔都出現(xiàn)重組蛋白的表達。~2105/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，接種四孔， DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)基于37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)，當細胞融合度達到90%時，用PBS洗1~2次，四孔細胞株分別加入600 μL 以上四種無血清表達培養(yǎng)基，并于24h、48h、72h、96h、168h各取樣5μL做Western blotting檢測（同方法三），比較分析差異。細胞融合度達到90%時，%胰蛋白酶消化吹散后接種至T75cm2方瓶中DMEM/F12 + 10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次逐級擴大培養(yǎng)，待細胞融合度達到90%時，用PBS洗3~4次，換無血清培養(yǎng)基CD CHO Medium+100L–Glutamine（終濃度為8 mM/mL）培養(yǎng)72h收集細胞上清1000 mL。 mL/min的流速進行漂洗。將細胞株接種于T25cm2方瓶中DMEM/F12 + 10%FBS培養(yǎng)基5mL培養(yǎng)。 mL/min的流速進行漂洗。將細胞株接種于T25cm2方瓶中DMEM/F12 + 10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)。第一步離子交換層析。洗脫緩沖液 (1PBS, mol/L ~ mol/L NaCl, ) 逐步升高NaCl濃度， mL/min流速進行洗脫，收集蛋白峰。 五、重組蛋白的定量檢測為檢測純化后蛋白濃度，采用Bradford分光光度法測定蛋白含量。以蛋白含量（μg）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制出標準曲線；稀釋待測蛋白樣品至合適濃度，使樣品稀釋液總體積為10μL，加入考馬斯亮藍G250溶液990μL，充分混勻，放置2min后，以標準曲線0號管做參比，在595nm波長下比色，記錄吸光值；根據(jù)所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應的蛋白質含量（μg），除以樣品稀釋液總體積（10μL），乘以樣品稀釋倍數(shù)即為蛋白樣品實際濃度。而轉染空質粒pMCE5的細胞上清無蛋白帶出現(xiàn)。對三次克隆化的Dot blotting檢測結果，運用GelPRO ，分析積分光密度值（表1）。對純化產物進行SDS–PAGE電泳和Western blotting分析（圖10），結果顯示重組蛋白純化效果較好，灰度分析顯示其純度為95%，無其他雜帶，純化后蛋白濃度明顯大于純化前。對純化產物進行SDS–PAGE電泳和Western blotting分析（圖11），結果顯示細胞表達上清經純化后在85kDa處有蛋白條帶，分子量與陽參蛋白（取第三次克隆化的C2孔細胞上清）一致，但雜帶較多純度不高。（2）第二步，方案Ⅰ: HiTrap Phenyl FF（1ml）離子交換層析，取第一步層析洗脫的活性組份10ml上柱純化。圖12 兩步法HiTrap SP HP柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE和 Western blotting分析M：標準分子量蛋白marker CCS：細胞培養(yǎng)上清Load：更換緩沖液后的細胞培養(yǎng)上清 FT：穿透液 NaCl：以不同梯度濃度NaCl洗脫的洗脫組分P：陽參蛋白 圖13 HiTrap SP HP+HiTrap Phenyl FF柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE和 Western blotting分析M：標準分子量蛋白markerLoad：更換緩沖液后的細胞培養(yǎng)上清FT：穿透液 Fractions：方案Ⅰ（HiTrap Phenyl FF）洗脫組分P：陽參蛋白圖14 HiTrap SP HP+ Lentil lectin Sepharose 4B柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE和 Western blotting分析M：標準分子量蛋白markerLoad：更換緩沖液后的細胞培養(yǎng)上清FT：穿透液 Fractions：方案Ⅱ（Lentil lectin Sepharose 4B）洗脫組分P：陽參蛋白圖15 HiTrap SP HP+ HiTrap Q HP柱層析純化gBt蛋白的SDS–PAGE和 Western blotting分析M：標準分子量蛋白marker1：方案Ⅲ（HiTrap Q HP）洗脫組分P：陽參蛋白五、重組蛋白含量測定Braford分光光度法測定蛋白含量，標準蛋白含量的標準曲線（圖12）。大腸桿菌表達系統(tǒng)，它具有表達水平高、操作簡單、周期短、易于大規(guī)模高密度培養(yǎng)、成本低等優(yōu)點，但對于全抗體和糖蛋白類生物藥物來說，表達產物多肽鏈的折疊、二硫鍵的形成、糖基化的有無以及糖基化的類型常常影響表達產物的合成分泌、生物活性、體內穩(wěn)定性以及免疫原性等特性[61]。在真核表達系統(tǒng)中，CHO 細胞是目前重組糖基蛋白生產的首選體系。 因此，CHO細胞株成為表達重組蛋白HSV I gB的理想宿主。本研究選擇穩(wěn)定表達系統(tǒng)，以保證重組蛋白長期、穩(wěn)定的表達。物理方法有電穿孔、顯微注射和基因槍，如電穿孔法：利用特殊實驗裝置產生高壓電，使細胞膜上瞬間穿開小孔，胞外溶液中的質粒DNA隨之進入胞漿。理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。脂質體介導轉染法適用性廣，重復性好，作用溫和，操作簡便。早在1972年Milstein等發(fā)現(xiàn)在人類當中成熟的IgG免疫球蛋白輕鏈要比IgG輕鏈的前體在N端少20個氨基酸。CHO表達亞單位疫苗有諸多優(yōu)勢，但用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO細胞成本高，在一定程度上限制了CHO細胞表達亞單位疫苗的發(fā)展。廣義上，無血清培養(yǎng)基分三種：無血清培養(yǎng)基 (Serum free，SFM) ，無需添加血清，但可能含有少量或者大量蛋白；無蛋白培養(yǎng)基（Protein Free Midium，PFM），血清和蛋白質（尤其動物蛋白）都沒有，可能會有些短肽；限定化學成分培養(yǎng)基（chemical defined Midium，CDM），培養(yǎng)基中的素有成分都是純化學合成的，成分完全已知。Ham’s F12與DMEM 等體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結合的培養(yǎng)基；FreeStyle CHO Expression Medium、CD CHO Medium、CD OptiCHO Medium是CDM，專用于CHO細胞表達分泌外源蛋白，均為非動物源性產品，用有生物活性的合成化學物代替天然的動物源性物質，所有組分均有明確的化學結構。將不含血清