【正文】 粒pMCE5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清，陰性對(duì)照2：陽(yáng)性克隆細(xì)胞株表達(dá)的HSV I gB3：標(biāo)準(zhǔn)蛋白maker1二、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的連續(xù)克隆化將24孔板中經(jīng)篩選的含重組蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，每個(gè)10 cm培養(yǎng)皿中接種約100個(gè)細(xì)胞，單克隆形成后轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)到80%~90%融合度時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基孵育72 h后Dot blotting檢測(cè)表達(dá)水平。結(jié)果一、穩(wěn)定高效表達(dá)重組蛋白的CHO細(xì)胞株篩選CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSV I gBt pMCE5后，經(jīng)G418 持續(xù)篩選，未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在含G418 的培養(yǎng)液中，8 d 內(nèi)全部離壁死亡，14 d 時(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞絕大部分死亡，但可見(jiàn)散在生長(zhǎng)的G418 抗性細(xì)胞克隆。此定量方法是利用考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，即結(jié)合后，溶液呈藍(lán)色，在波長(zhǎng)595nm有較高的吸收值，而且在一定得范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量呈線性關(guān)系。SDS–PAGE蛋白電泳和Western blotting分析純化的目的蛋白，方法同前。將HiTrap SP HP柱5mL裝填后連接層析儀器，用5CV結(jié)合緩沖液(1PBS, ) mL/min的流速平衡層析柱。細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，%胰蛋白酶消化吹散后接種至T75cm2方瓶中DMEM/F12 + 10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。洗脫緩沖液 (1PBS, mol/L ~ mol/L NaCl, )逐步升高NaCl濃度， mL/min流速進(jìn)行洗脫，收集蛋白峰，超濾離心置換緩沖液 (1PBS, )。細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，%胰蛋白酶消化吹散后接種至T75cm2方瓶中DMEM/F12 + 10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，依次逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，用PBS洗3~4次，換無(wú)血清培養(yǎng)基CD CHO Medium+100L–Glutamine（終濃度為8 mM/mL）培養(yǎng)72h收集細(xì)胞上清1000 mL。用12 mL洗脫緩沖液 (1PBS, mol/L NaCl, 500 mmol/L imidazole, ) mL/min流速進(jìn)行洗脫，收集蛋白峰，超濾離心置換緩沖液 (1PBS, mol/L NaCl, )。②將Ni Sepharose 6 FF凝膠3mL裝填到層析柱上連接層析儀器，用5倍柱體積(CV) 的結(jié)合緩沖液(1PBS, mol/L NaCl。確定最佳的無(wú)血清表達(dá)培養(yǎng)基及最佳收集細(xì)胞上清的時(shí)間，從而優(yōu)化表達(dá)重組蛋白的條件。Dot blotting檢測(cè)選取的單克隆細(xì)胞在96孔板中表達(dá)72 h后，每個(gè)克隆孔取5 μL表達(dá)上清液，滴加在硝酸纖維素膜上，室溫放置30 min后置于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉1 h，小鼠抗His單抗（1 mg/mL）1：5000稀釋于封閉液中，室溫孵育2 h，TBST洗膜310 min，羊抗小鼠IgG–HRP 1：5000稀釋于封閉液中，室溫孵育1 h，TBST洗膜310 min，稍瀝干后化學(xué)發(fā)光底物液均勻滴加在膜硝酸纖維素膜上，避光反應(yīng)5 min，稍瀝干，放入暗盒于暗室中壓片，根據(jù)熒光強(qiáng)度決定曝光時(shí)間。（9）顯影、定影：暗室中剪一塊與膜大小相似的X線膠片，根據(jù)膜上發(fā)光條帶的亮度選擇壓片時(shí)間（3 s~30 min），膠片置于顯影液中漂洗至目的條帶顯現(xiàn)（約1~3 min），然后置于定影液中定影。（6）一抗孵育：小鼠抗His單抗（1 mg/mL）1：5000稀釋于封閉液中，與硝酸纖維素膜室溫孵育2 h，TBST洗膜310 min。（3）SDS–PAGE蛋白電泳：取處理好的樣品20 181。LTEMED 181。5%濃縮膠：H2O mL30%丙烯酰胺 181。（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制：12%分離膠：H2O mL30%丙烯酰胺 mL Tris pH mL10%過(guò)硫酸銨 181。將混合物共100 μL加入到24孔板中（500 μL/孔），輕輕混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。具體步驟如下：稀釋質(zhì)粒：分別以50 μL無(wú)血清DMEM/ μg~ μg的重組質(zhì)粒DNA和空載體DNA。CHO細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存（二）主要試劑與儀器設(shè)備Lipofectamine TM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；FreeStyle CHO Expression Medium、CD CHO Medium、CD OptiCHO Medium、DMEM/F1% trypsin、100L–Glutamine、G418為GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為Costar公司產(chǎn)品；10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿為NEST公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（T25cmT75cmT175cm2）為Corning公司產(chǎn)品；小鼠抗His單抗、羊抗小鼠IgG–HRP為金斯瑞公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜（Hybond–C）為Amersham公司產(chǎn)品；醫(yī)用X射線膠片（X–OMAT BT）為柯達(dá)公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光底物（Immobilon Western）為Millipore公司產(chǎn)品；Ni Sepharose 6 Fast Flow (FF) 、HiTrap SP High Performance (HP) 、HiTrap Phenyl Fast Flow (FF) 、Lentil lectin Sepharose 4B、HiTrap Q High Performance (HP)為GE公司產(chǎn)品。用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法，將重組質(zhì)粒HSV I gBt pMCE5導(dǎo)入CHO細(xì)胞中，通過(guò)G418篩選獲得轉(zhuǎn)入目的基因的陽(yáng)性細(xì)胞克隆?；虻倪@種重新設(shè)計(jì)是提高異源基因表達(dá)水平的重要措施。因此，制備重組蛋白時(shí)，要獲得重組蛋白的高水平表達(dá)，應(yīng)在不改變氨基酸組成的前提下，對(duì)目的基因進(jìn)行分析處理。并且如果相同的稀有密碼子不斷地重復(fù)出現(xiàn)，可能會(huì)導(dǎo)致密碼子的錯(cuò)配[59]。實(shí)際上用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物（包括大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞）都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛(ài)，即在不同宿主中同一氨基酸對(duì)應(yīng)的不同密碼子之中也有使用頻率的高低之分。然而，計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性依賴于已知表位信息及表位數(shù)據(jù)庫(kù)的大小，預(yù)測(cè)結(jié)果也需要應(yīng)用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行證實(shí)?？乖砦皇菦Q定蛋白質(zhì)抗原性的特殊化學(xué)基團(tuán)，也與生物機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。gB還是皰疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株間差異小，且與所有的皰疹類病毒亞群有較大的同源性[54]。經(jīng)測(cè)序，擴(kuò)增出的DNA序列與設(shè)計(jì)合成的HSV I gBt基因序列進(jìn)行比對(duì)，100%匹配且目的基因片段插入載體后其翻譯閱讀框架正確。圖3 重組質(zhì)粒HSV I gBt pMCE5的菌體PCR鑒定1：DNA marker（DL 2000）2~9：1~8號(hào)重組子10：含有pMCE5空質(zhì)粒的對(duì)照菌雙酶切鑒定分別挑取菌體PCR鑒定陽(yáng)性的重組子，提取質(zhì)粒后進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定。重新合成的全新基因序列HSV I gBt（圖2），更易于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)和純化。并去除了胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)及蛋白自帶的信號(hào)肽。②%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）電泳鑒定（80 V，40 min），凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。LEcoR I 181。（3）、重組質(zhì)粒的酶切鑒定：①將PCR鑒定的陽(yáng)性克隆菌培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定目的基因片段是否插入載體酶切位點(diǎn)之間。L滅菌石蠟油后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。LDNA（模板） 181。LP1（上游引物，10 pmol/181。③于4℃以12000 rpm離心5 min，上清即為PCR鑒定用模板。端避開(kāi)密碼子的第3位；避免形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，設(shè)計(jì)引物如下：HSV I gB（1538bp，EcoR I + Not I）上游引物P1：GCAAGCTTGCCGCCACCATGGAA下游引物P2：GCGGATCCTTAGCTAGAGGTAGT（2）、重組質(zhì)粒的PCR鑒定：①于上述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)平板上挑取若干個(gè)單菌落分別接種于3 mL含Ampr（100 181。④轉(zhuǎn)化液混勻后取200 181。L DH5α感受態(tài)細(xì)菌懸液和10181。~，將菌液置冰上冷卻后，于4℃以4000 rpm離心10 min沉淀細(xì)菌。LT4 DNA Ligase 181。）（14）12000 rpm離心1 min洗脫DNA，收集于－20℃保存?zhèn)溆?。?2）重復(fù)操作步驟11。）（10）將500 181。當(dāng)分離小于400 bp 的DNA片斷時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。L 進(jìn)行計(jì)算。）（3）切碎膠塊。具體步驟如下：（1）使用TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，對(duì)目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。LEcoR I 181。L反應(yīng)體系進(jìn)行，并選用兩種酶切割效率都較高的緩沖液。）（12）12000 rpm離心1 min洗脫DNA。（10）重復(fù)操作步驟9。（8）將500 181。L預(yù)冷的Solution III，輕輕顛倒試管混勻4–6次，有沉淀生成，室溫靜置2 min。L Solution I（用前加RNase A, 4℃保存）重懸沉淀，混勻。參考OptimumGeneTM軟件分析數(shù)據(jù)，采用最佳密碼子，去除去穩(wěn)定序列，減少了AT和GC重復(fù)，使mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并且提高了目的基因中G+C的含量，消除富含AT的序列區(qū)段，避免翻譯的提前終止等。（四） 主要試劑與儀器設(shè)備PrimeSTAR HS（Premix）DNA Polymerase、EcoR I、 Not I、T4 DNA連接酶、核酸分子量marker（DL 2000；250 bp ladder）、質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit ）、PCR產(chǎn)物純化試劑盒（TaKaRa DNA Fragment Purification Kit ）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit ）為TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品；其它常用試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純以上級(jí)產(chǎn)品。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析工具對(duì)HSV I gB抗原表位進(jìn)行分析，篩選出抗原表位較富集的胞外區(qū)片段；優(yōu)化基因序列，選用真核細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子，重新設(shè)計(jì)合成基因gBt，并克隆至pMCE5載體中，構(gòu)建適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的真核載體。直接ELISA法檢測(cè)純化后重組gBt蛋白的抗原性； 以重組蛋白免疫小鼠制備多抗血清，間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)，評(píng)價(jià)其體液免疫效果。獲得的高表達(dá)重組蛋白經(jīng)純化、鑒定后，免疫小鼠制備抗血清，并對(duì)其抗原性和免疫活性進(jìn)行檢測(cè)。研究表明：為增強(qiáng)編碼抗原蛋白的免疫原性，可去除其部分功能性編碼序列，特別在完整抗原蛋白對(duì)宿主具有毒性或免疫抑制作用的情況下，對(duì)抗原蛋白進(jìn)行截短表達(dá)就尤為重要。它是皰疹病毒家族中高度保守的蛋白，各毒株間差異較小，且與所有的皰疹類病毒亞群有較大的同源性[47]。Ghiasi 等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出8種HSV I糖蛋白，比較了它們的免疫原性和保護(hù)作用。廣州軍區(qū)總院[4142]，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院等單位的初步研究結(jié)果顯示HSV II核酸疫苗可刺激小鼠產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但在人體中的安全性問(wèn)題尚難確定。核酸疫苗是用包含病毒基因的DNA質(zhì)粒接種體內(nèi)，在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)病毒蛋白從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[3637]。另一種由Glaxo Smith Kline公司開(kāi)發(fā)的gD2聯(lián)合佐劑AS04，在兩個(gè)III期的臨床試驗(yàn)中能對(duì)HSV血清陰性的婦女提供有效的保護(hù)（有效率分別為73%和74%），而對(duì)血清反應(yīng)陽(yáng)性的婦女則效果有限（有效率分別為46%和39%）[33]。目前已發(fā)現(xiàn)并正式命名的HSV包膜糖蛋白共有12種，它們以獨(dú)特或復(fù)合體的形式在HSV復(fù)制循環(huán)及病毒的感染致病中發(fā)揮不同作用[29]。發(fā)現(xiàn)含全長(zhǎng)基因片段的質(zhì)粒能引起強(qiáng)的細(xì)胞免疫，但僅能引起較低的抗體水平；含部分基因片段的質(zhì)粒能引起高效價(jià)的抗體水平，但只有很弱的細(xì)胞免疫[27]。一方面，毒株的弱毒力不穩(wěn)定，可能返祖；另一方面，病毒會(huì)潛伏在宿主體內(nèi)，如果宿主機(jī)體抵抗力下降，弱毒株也將對(duì)機(jī)體造成損害，而且，對(duì)女性來(lái)說(shuō)，還有潛在致癌的可能性。滅活疫苗既可用于預(yù)防HSV感染，也可用于治療HSV感染。不少研究證實(shí)，阿昔洛韋、伐昔洛韋和泛昔洛韋抑制治療法可顯著減少生殖器皰疹的有癥狀復(fù)發(fā)和無(wú)癥狀排毒，但臨床上使用這些抗病毒藥物治療HSV感染時(shí)，常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象而影響療效[21]。在美國(guó)總?cè)丝谥?，?0年HSV II血清流行率增加了1/3，達(dá)23%[14]。HSV I是世界上流行最廣的病毒性感染之一，其特點(diǎn)是每次復(fù)發(fā)病變往往發(fā)生于同一部位。在免疫正常者中HSV感染很少導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，但在免疫缺陷者中卻可導(dǎo)致嚴(yán)重疾病或并發(fā)癥，在孕婦中可引起宮內(nèi)感染和新生兒皰疹而嚴(yán)重影響優(yōu)生優(yōu)育。HSV有二個(gè)血清型，即HSV I型和HSV II型，迄今為止已測(cè)定了HSV I和HSV II基因組的全部序列，序列分析顯示二者在核苷酸序列、框架結(jié)構(gòu)、編碼蛋白質(zhì)功能上存在較大同源性，型間有共同抗原，也有特異性抗原。外膜為雙層類脂質(zhì)，膜上有糖蛋白短突起。HSV為有包膜的DNA 病毒，屬皰疹病毒科α亞科，由外膜、核衣殼、皮質(zhì)層和核酸組成。其基因組為一線性雙鏈DNA分子，由共價(jià)連接的長(zhǎng)片段 (L) 和短片段 (S) 組成，兩者分別占病毒DNA的 82 % 和18 % ，每一片段由中間的獨(dú)特序列 (U) 和兩端的倒置重復(fù)序列組成，根據(jù)L和S片段相互連接方式的不同可有4 種同分異構(gòu)體[24]。同時(shí)，HSV I引起的生殖性皰疹也日益增多。當(dāng)受到外界刺激如物理、情感壓力、發(fā)熱、紫外線照射、組織損傷或免疫抑制等，潛伏的病毒激活增殖，沿神經(jīng)纖維索下行至感覺(jué)神經(jīng)末梢，至附近表皮細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)增殖，引起復(fù)發(fā)感染[79]。HSV的感染在全世界都非常普遍。HSV II的感染率在患有性病、%，%。盡管現(xiàn)有的抗病毒藥物應(yīng)用能縮短病毒感染的病程，促進(jìn)皮損愈合、縮短排毒時(shí)間、減輕傳染性，防止并發(fā)癥，并且對(duì)治療復(fù)發(fā)性感染取得一些效果，但這些抗病毒藥物不能有效預(yù)防皰疹病毒原發(fā)感