zhou目的蛋白質(zhì)表達、純化、檢測(1)-全文預覽
【正文】 目的基因融合表達（ N端或者 C端融合表達）。 ? 元件 – 啟動子、終止子、核糖體識別序列 – 誘導性表達所需要的元件 ? 操縱子序列 ? 調(diào)控基因 – 多克隆位點 – 融合 Tag – 復制起始序列 – 篩選標記 /報告基因 ? 各種表達載體的不同之處 在于其表達元件的差異。 實驗原理 ? 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 – 目的基因 – 表達載體 Plasmid Tag lacIq Promoter Ampr 多克隆位點 實驗原理 ? 目的基因 / DNA / PCR / 酶切 / Primer ? 例： ? p38中抑制多肽 16肽序列 – GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC ? F 5’ACG GAT CC TA GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT3’ ? R 5’ACG GAT CC TTA GAG CTT CAA CTG ATC AAT ATG G3’ ? 5’端引物中 AC是隨機保護堿基， G GAT CC是 BamH I酶切位點，TA是為防止移碼而引入的兩個堿基，隨后是編碼 16肽前 7個氨基酸的堿基序列。實驗五 目的基因的原核表達及檢測 現(xiàn)代分子生物學大實驗 實驗目的 ? 重點掌握 表達載體構(gòu)建 的原理及方法 ? 掌握目的基因原核 誘導表達 的原理及方法 ? 了解目的蛋白質(zhì) “ 標簽 ” 純化 的基本原理和方法 ? 掌握 PAGE變性凝膠電泳 的原理及方法 ? 掌握 考馬斯亮藍染色 的方法 實驗原理 ? 目的蛋白質(zhì)的誘導表達 ? 目的蛋白質(zhì)的純化 ? 目的蛋白質(zhì)的檢測 實驗原理 ? 蛋白質(zhì)的表達：將 克隆基因 插入 合適載體 后導入 宿主細胞 表達大量蛋白質(zhì)的方法。 – 大名鼎鼎的 BL21(DE3)融源菌則是添加 T7聚合酶基因，為 T7表達系統(tǒng)而設計。在基本骨架的基礎(chǔ)上增加 表達元件 ，就構(gòu)成了表達載體。 lac和 Tac， PL和PR， T7是最常用的啟動子， ? 轉(zhuǎn)錄終止子 ? 核糖體結(jié)合位點 啟動子、終止子、核糖體識別序列 操縱子序列及配套的調(diào)控基因 ? 誘導性表達所需要的元件 多克隆位點 復制起始序列 實驗原理 ? 用作分離的載體蛋白被稱為 標簽蛋白或標簽多肽 （ Tag） 。 實驗原理 ? 篩選標記 /報告基因表達 ? 抗藥性基因， Amp是最常見的篩選標記， kana，新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素
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