【正文】 而距離約束的上限則需全面洞察 NOE信號(hào)強(qiáng)度的總體情況進(jìn)行分類 ， 一般可分成強(qiáng) 、 中 、 弱三類 NOE， 分別對(duì)應(yīng)距離~ nm、 ~ nm和 nm 。 (3)反映主鏈規(guī)則排布的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元 多維核磁共振的化學(xué)位移參數(shù)可以直接提供蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息， 并已用于直接判斷構(gòu)成 ?螺旋及 ?折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的氨基酸肽段 。 所以 ， 蛋白質(zhì)分子的 1H、 13C和 15N共振譜線的化學(xué)位移反映了蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)及局域微環(huán)境結(jié)構(gòu)情況 。 在蛋白質(zhì)分子中 ， 15N1H、13C1H、 13C13C等異核之間的單鍵 J 耦合常數(shù)都具有較大值 ， 這是異核多維核磁共振方法的基礎(chǔ) 。 交叉弛豫將導(dǎo)致核自旋之間的磁化強(qiáng)度轉(zhuǎn)移 ， 從而引起 NOE的發(fā)生 。 在外加靜磁場(chǎng) （ 恒定超導(dǎo)磁場(chǎng) ） H0的作用下 ， 這些核自旋量子數(shù)不為零的核能級(jí)發(fā)生分裂 。 多維異核核磁共振實(shí)驗(yàn)主要是檢測(cè)蛋白質(zhì)中 1H、 13C、 15N核之間的相關(guān)共振信號(hào) ， 用以提取確定蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本信息 。thrich 。 ?核磁共振是 1946 年由美國(guó)斯坦福大學(xué)布洛赫()和哈佛大學(xué)珀賽爾 ()各自獨(dú)立發(fā)現(xiàn)的 ， 兩人因此獲得 1952年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng) 。 電子密度圖的分析和建立結(jié)構(gòu)模型總是和修正原子坐標(biāo)改善位相 ， 從而改進(jìn)圖的質(zhì)量并給出更多的原子結(jié)構(gòu)的信息這樣一個(gè)過程分不開 ， 反復(fù)進(jìn)行 ， 從而獲得最后的解 。但因 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜 ， 并不是所有相同分辨率的圖都能得到相同水平的結(jié)果 。 在有了一定結(jié)構(gòu)信息的基礎(chǔ)上 ， 還可以不斷將結(jié)構(gòu)信息輸入以改善位相信息從而改善電子密度圖 ，并通過修正擴(kuò)充位相信息而使分辨率提高 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在全自動(dòng)化收集并處理數(shù)據(jù)的過程中 （ 一體化 ） ， 還應(yīng)考慮一個(gè)很重要的內(nèi)容 ， 就是 實(shí)時(shí) （ atthetime ） 數(shù)據(jù)質(zhì)量的評(píng)估 ，如晶體逐漸的衰敗 、 晶體形狀因子的校正 。 氙更喜歡定位于蛋白質(zhì)的疏水袋中 ， 雖然也可結(jié)合到各種各樣的地方 ， 但和一般重原子衍生物的結(jié)合位不同 ， 所以早已被使用來制備重原子衍生物了 ， 起碼不失為一種浸泡法的補(bǔ)充 。 而且 ，對(duì)用細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì) ， 特別是蛋白質(zhì)中就含有蛋氨酸 ， 這是不難辦到的 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 5 多波長(zhǎng)反常散射法 多波長(zhǎng)反常散射法 （ MAD ） 是一種有可能快速批量測(cè)定蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的有效方法 ， 它是在 DNA 重組蛋白定位制備重原子衍生物等實(shí)驗(yàn)技術(shù)和第三代同步加速器輻射的廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 。 由于分子臵換法的計(jì)算技術(shù)不斷改進(jìn)和高精度衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)的使用 ， 現(xiàn)在 1~2 天解一個(gè)相似結(jié)構(gòu)的情況已很普通 ， 是 突變蛋白結(jié)構(gòu)解析的主要方法 。 帕特森分析對(duì)位臵少 、 占有率高的重原子可以給出較滿意的結(jié)果 ， 但對(duì)位臵多 、 占有率低的重原子則很難分析 。 這種方法也不很有效 ， 已不多用 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)衍射強(qiáng)度的變化 ， 首先可以借助于帕特遜分析算出重原子的位臵 ， 從而獲得重原子的結(jié)構(gòu)振幅和位相的信息 ， 因?yàn)楦鶕?jù)實(shí)驗(yàn)可以直接測(cè)得重原子衍生物和母體的結(jié)構(gòu)振幅 （ 從強(qiáng)度 ）， 所以可以建立矢量三角形 （ 圓 ） 來推出母體的位相 。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)晶體中引進(jìn)了適當(dāng)?shù)闹卦雍?， 就造成該晶體衍射線強(qiáng)度的差別 ， 從衍射強(qiáng)度的差別就有可能推出位相信息 。 在已知結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上 ， 解決不同種屬不同來源的突變蛋白或它的復(fù)合物結(jié)構(gòu)還可以使用 分子臵換法和差值電子密度法 。 晶體的收集 、 貯存 、 標(biāo)識(shí)和運(yùn)輸就是一個(gè)大問題 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 為了不使衍射斑點(diǎn)重疊 ， 必須使晶體每次僅回?cái)[一個(gè)很小范圍， 通常是 1176。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 四圓衍射儀數(shù)據(jù)精確 ， 數(shù)據(jù)重復(fù)誤差只有 2 ％ 左右 ，但因?yàn)槭侵瘘c(diǎn)收集 ， 所以收集一套數(shù)據(jù)很費(fèi)時(shí) ， 這對(duì)大晶胞晶體收集數(shù)據(jù)時(shí)間之長(zhǎng)是難以忍受的 。 早期使用的外森堡相機(jī)和徘循相機(jī)是專門設(shè)計(jì)成使用 X 射線底片的相機(jī) 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 2. X 射線源的選擇 無論是哪種輻射源 ， 還 要求射線的發(fā)散度盡量小 ， 這又是同步加速器輻射的一大特點(diǎn) 。 水分子和蛋白質(zhì)中的解離基團(tuán)或酰胺基團(tuán)形成氫鍵 ， 構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個(gè)組成部分 ， 因而 ， 失水的晶體會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 。 小分子晶體的偏光性強(qiáng)于蛋白質(zhì)晶體 ， 但使用偏光多用來鑒定晶體或其他非晶態(tài)物質(zhì) ， 如玻璃碎片 、 玻璃壁上的小氣泡 、 無定形沉淀等 。 同時(shí) ， 因?yàn)樗纳鲜鰞?yōu)點(diǎn) ， 也使它非常適合于晶體生長(zhǎng)的條件摸索實(shí)驗(yàn) 。 將蛋白質(zhì)的過飽和溶液配好 ， 根據(jù)體積大小分裝在大小不同的試管中并密封， 然后臵于培養(yǎng)箱中控制各項(xiàng)物理因素 (溫度 、 防震 …… ） 。 反過來說 ， 基于同樣的理由 ， 有一種晶體生長(zhǎng)方法是專門利用溫度來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶解度的 ， 其先決條件是溫度必須是單向緩慢地變化 ， 即由高溫到低溫的緩慢變化 ， 使蛋白質(zhì)溶解度緩慢降低而達(dá)到過飽和 ， 這就是有名的 熱盒子法 。 比如 ， 應(yīng)該了解離子強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)的影響 ，必要時(shí)做實(shí)驗(yàn)曲線了解 ? 鹽析 ? 或 ? 鹽溶 ? 的范圍 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng) 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 2 晶體生長(zhǎng)的生物化學(xué)條件 小分子晶體生長(zhǎng)的自由能 、 相平衡理論 ， 溶質(zhì) 、 溶劑分散以及排斥和相互作用的學(xué)說等很難應(yīng)用于蛋白質(zhì)的晶體生長(zhǎng) ， 由于蛋白質(zhì)構(gòu)象固有的復(fù)雜性 ， 目前尚無法對(duì)溶液中的自由能 、 固態(tài)中可能形成的鍵數(shù)以及鍵能等因素進(jìn)行精確的理論計(jì)算和預(yù)測(cè) ， 所以 ， 蛋白質(zhì)的晶體生長(zhǎng)仍以經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為主 。 1 對(duì)原材料的要求 ① 晶體的重要特征是其內(nèi)部的高度有序性 ， 所以 要求能夠生長(zhǎng)晶體的原材料也應(yīng)具有高度的均一性 。 這就要求發(fā)展 快速批量表達(dá)基因 的方法 ， 與蛋白質(zhì)純化 、 培養(yǎng)晶體 、 數(shù)據(jù)收集 、 分析結(jié)構(gòu)形成 ? 一條龍 ?， 使用最先進(jìn)的軟件和技術(shù)使晶體結(jié)構(gòu)分析達(dá)到全自動(dòng)化 。 第三代同步輻射的應(yīng)用 ， 使晶體小到20~40nm的蛋白質(zhì)復(fù)合物等結(jié)構(gòu)得以測(cè)定并達(dá)到原子分辨率水平 。 所以 蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)技術(shù)也成了蛋白質(zhì)晶體學(xué)發(fā)展的一部分 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 數(shù)據(jù)精度不夠就需要改進(jìn)收集衍射數(shù)據(jù)的儀器設(shè)備 。 經(jīng)歷了整整 20年 ， 第一張完美的蛋白質(zhì)晶體 ― 胃蛋白酶 的 X 射線衍射照片才出世 。 晶胞存在的可能的 230 個(gè)空間群 ， 就是利用一定的對(duì)稱操作將某物質(zhì)的可重復(fù)部分在 14 種晶體點(diǎn)陣上的安排加以總結(jié)的結(jié)果 。 也就是說 ， 組成晶體的分子 、 原子在三維空間中是嚴(yán)格按著一定次序周期排布的 ， 只有這樣才能形成衍射光柵 。 當(dāng)然 ， 光有布拉格公式還是不夠的 ， 因?yàn)樗鼉H僅將光柵結(jié)構(gòu) （ 晶體中晶胞的大小和形狀 ， 包括它的對(duì)稱性） 和衍射方向聯(lián)系了起來 ， 至于晶胞中的原子種類及其在晶胞中的分布位臵還要靠衍射線的強(qiáng)度信息才能推導(dǎo)出來 。 X 射線衍射是勞厄 （ Laue ） 等人在 1912 年發(fā)現(xiàn)的 。 X 射線的生成主要有兩種完全不同的方式 ， 一種是陽極靶材料受到高能電子的轟擊 ， 原子的內(nèi)層電子躍遷到外層后又跳回內(nèi)層發(fā)出的所謂 特征 X 射線 。 ☆ 1. X 射線 X 射線是德國(guó)物理學(xué)家 倫琴 在 1895 年發(fā)現(xiàn)的 。 它是使用同步加速器的高能物理研究實(shí)驗(yàn)室所提供的寄生輻射 ， 其波長(zhǎng)在 nm~1 ?m 之間 （ 從紫外線到 X 射線 ） ， 見圖 520。 晶體中分子內(nèi)原子間距在 nm 范圍左右 ， 所以使用波長(zhǎng) nm 左右的 X 射線可以使晶體產(chǎn)生衍射現(xiàn)象 ， 這是因?yàn)楹送怆娮由⑸?X 射線的結(jié)果 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 晶體 晶體是衍射光柵 ， 是 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析的研究對(duì)象。 于是， 晶胞的選取只有 7種類型 ， 稱為 7種晶系 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 圖 56 晶體中晶胞和不對(duì)稱單位的關(guān)系 。 所謂重原子 ， 就是元素周期表中 碘原子 以上的原子 ， 相對(duì)于構(gòu)成蛋白質(zhì)的碳 、 氮 、 氧原子來說它們就是重原子 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析方法沒有突破以前 ， 培養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體當(dāng)然不是個(gè)主要問題 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 科學(xué)的發(fā)展正使人們發(fā)現(xiàn)一些更簡(jiǎn)單的方法最終可以直接看到復(fù)雜的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 。該學(xué)科是以生命物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)性為基礎(chǔ)來闡明生命活動(dòng)本質(zhì)的一門學(xué)科 ， 特別是在人體基因組定位之后 ， 又發(fā)展成為 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)或稱結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)學(xué)， 其目的就是獲得全部蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 。 ② 晶體生長(zhǎng)并經(jīng)冷凍技術(shù)處理； ③ 重原子衍生物制備； ④ 衍射數(shù)據(jù)收集； ⑤ 衍射數(shù)據(jù)分析和改進(jìn)； ⑥ 獲得最后的結(jié)構(gòu)模型 （ 包括修正 ） 。 1 對(duì)原材料的要求 ③ 在拿到樣品之后 ， 最好是 做一個(gè)等電聚焦 ， 考察一下是否是一條帶 ， 若不是就要小心了 。 如果這個(gè)過程發(fā)展得太快 ， 盡管晶體生長(zhǎng)的條件已經(jīng)滿足 ， 蛋白質(zhì)還是完全有可能以 無定 形狀態(tài)或 微晶 從溶液中析出 。 一般情況下 ， 蛋白質(zhì)皆不能耐受高溫 ， 大多數(shù)蛋白質(zhì)在 60~70℃ 下要變性 ， 有些蛋白質(zhì)只有在低溫下才能保持其活力 。 但是震動(dòng)問題不易控制 ， 因此失敗的例子也不少 ， 這也說明了防震的重要性 。 由于鹽濃度不同 ， 造成懸滴和貯液槽之間的水蒸氣壓力的不同 ， 從而發(fā)生水蒸氣的交換 ， 使懸滴中蛋白質(zhì)濃度逐步變濃 ， 從而達(dá)到蛋白質(zhì)緩慢的過飽和 。 在低倍光學(xué)顯微鏡下使用針來觸碰微晶 ， 可以感到小分子晶體偏硬 ， 容易碎成兩半或幾瓣；蛋白質(zhì)晶體偏軟 ， 容易碎成粉 。 所以 ， 層層把關(guān)是必要的 。 收集低溫冷凍的晶體不使用毛細(xì)管而是使用特殊的小圓環(huán) ， 將晶體連同母液用這個(gè)小圓環(huán)取出來 ， 然后迅速臵于液氮中冷凍 。 按 記錄裝臵的運(yùn)動(dòng)方式 分 ， 又有外森堡相機(jī) 、 徘循相機(jī) 、 回?cái)[相機(jī) 、 四圓衍射儀等之分 。 四圓中的 3 個(gè)圓是調(diào)節(jié)晶體方位的 ， 另一個(gè)圓在水平平面上調(diào)節(jié)計(jì)數(shù)管方位 。 記錄裝臵的運(yùn)動(dòng)方式中最重要的一種方式為 回?cái)[法 。 回?cái)[運(yùn)動(dòng)實(shí)際上是晶體在測(cè)角頭上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)的運(yùn)動(dòng) ， 探測(cè)器面板垂于入射線在晶體的后方 ， 與晶體的距離可調(diào) 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析的核心問題是位相問題 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 1 數(shù)據(jù)的統(tǒng)一和還原 為了解出一個(gè)晶體結(jié)構(gòu) ， 往往需要使用許多晶體收集到該蛋白質(zhì)的多套數(shù)據(jù) ， 其中包括母體數(shù)據(jù)以及一個(gè)以上的重原子衍生物的數(shù)據(jù) 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 所謂 重原子衍生物 是指在蛋白質(zhì)晶體中通過某種方式引入原子序數(shù)遠(yuǎn)大于碳 、 氮 、 氧的重原子而構(gòu)成的晶體 。 ① 通過一些化學(xué)反應(yīng)使蛋白質(zhì)某個(gè)基團(tuán)與重原子化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ， 使它們之間形成共價(jià)鍵的連接 ， 然后進(jìn)行晶體生長(zhǎng) 。 最根本的鑒定還是通過 X射線衍射實(shí)驗(yàn) ，觀察衍射斑點(diǎn)的情況 。 對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造和修飾甚至借助于天然分子骨架構(gòu)建新的蛋白質(zhì) ， 也有望使用這種方法解出結(jié)構(gòu) 。 結(jié)構(gòu)經(jīng)修正后可以精確地顯示酶與底物的結(jié)合 ， 其中包括底物的結(jié)構(gòu)和酶結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化 ， 是一種最簡(jiǎn)單的解結(jié)構(gòu)的方法 。 可喜的是 ， 在過去的 10余年中 ， 已經(jīng)發(fā)展出了一些可以應(yīng)用的方法 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 雖然占有率不高 ， 但這一弱點(diǎn)恰恰被第三代同步加速器的高能量 、 細(xì)聚焦的優(yōu)點(diǎn)所彌補(bǔ) ， 收集高精度的反常散射數(shù)據(jù)可以使它提供位相信息 。 現(xiàn)有的程序已經(jīng)相當(dāng)好 ， 自動(dòng)化程度已相當(dāng)高 ， 使用方便 ， 速度也很決 。 電子密度圖是晶體結(jié)構(gòu)分析的直接結(jié)果 ，它包含了結(jié)構(gòu)的全部信急 ， 如何從一套電子密度圖分析出這些信息 ， 尚有一系列問題需要解決 。 還有一種廣泛用于二維圖像和照片的修飾方法稱為 網(wǎng)格圖 （ histogram ） 修飾法 ， 也可用于電子密度圖的修飾 。 nm 左右分辨率的圖往往可以正確解出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并給出原子模型 ， 并且可以分析晶體中有序水的結(jié)構(gòu) 。 R因子是結(jié)構(gòu)振幅觀測(cè)值和計(jì)算值一致性的一個(gè)度量 。thrich 教授實(shí)驗(yàn)室首次運(yùn)用核磁共振方法解析了胰高血糖素 （ glucagon） 多肽的溶液構(gòu)象 ，并在 1985 年運(yùn)用二維同核核磁共