【正文】 用它來計(jì)算原子間的矢量 。 最根本的鑒定還是通過 X射線衍射實(shí)驗(yàn) ，觀察衍射斑點(diǎn)的情況 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在制備重原子衍生物的過程中 ， 要不斷對衍生物進(jìn)行鑒定 ， 直到獲得滿意的重原子位臵為止 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ③ 簡單而又實(shí)用的方法就是 浸泡法 ， 特別是有了一定經(jīng)驗(yàn)之后， 花一段時間 ， 總可以找到一些合用的衍生物 。 ② 將重原子化合物與蛋白質(zhì)在溶液中混合在一起生長晶體 ， 稱為共晶生長 。 ① 通過一些化學(xué)反應(yīng)使蛋白質(zhì)某個基團(tuán)與重原子化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ， 使它們之間形成共價鍵的連接 ， 然后進(jìn)行晶體生長 。 這種不改變蛋白質(zhì)周期排布而又在固定位臵引入重原子的方法就叫做 ? 同晶臵換 ? ， 這種晶體又稱為同晶臵換重原子衍生物 。 所引進(jìn)的重原子必須對晶體沒有大的破壞 ， 即不改變原來晶體中蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和周期排列 。 這些重原子對 X 射線的散射強(qiáng) ， 有可能改變由碳 、 氮 、 氧組成的蛋白質(zhì)晶體的 X 射線衍射斑點(diǎn)的強(qiáng)度 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 所謂 重原子衍生物 是指在蛋白質(zhì)晶體中通過某種方式引入原子序數(shù)遠(yuǎn)大于碳 、 氮 、 氧的重原子而構(gòu)成的晶體 。 如果重原子有較強(qiáng)的反常散射 ， 一個重原子衍生物加上反常散射信息也可解決位相的雙解問題。 下面按順序介紹重原子衍生物的制備 、 帕特遜分析 、 同晶臵換法的基本原理 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 2 同晶臵換法 同晶臵換法 是由 Peruz于 20 世紀(jì) 50 年代發(fā)現(xiàn)的可以用于解決位相信息的方法 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 1 數(shù)據(jù)的統(tǒng)一和還原 為了解出一個晶體結(jié)構(gòu) ， 往往需要使用許多晶體收集到該蛋白質(zhì)的多套數(shù)據(jù) ， 其中包括母體數(shù)據(jù)以及一個以上的重原子衍生物的數(shù)據(jù) 。 但晶胞中的原子種類以及它在晶胞中的分布位臵決定了衍射線強(qiáng)度；反過來 ， 通過衍射線強(qiáng)度和一些方法 ， 可以了解位相信息 ， 從而通過富里衰加和獲得電子密度函數(shù) ， 從而獲得原子在晶胞中的分布位臵 ， 這就是 晶體結(jié)構(gòu)測定的目的和結(jié)果 。由于同步加速器輻射光源的改進(jìn) ， 目前多波長的 反常散射法 （MAD ） 已趨成熟 ， 大有取代同晶臵換法的可能 ， 使解決位相問題大大簡化 ， 這對結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究至關(guān)重要 。 最基本的方法 ， 也是用于一個未知結(jié)構(gòu)的最有效方法是 同晶臵換法 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析的核心問題是位相問題 。 這些步驟目前仍處于手工勞動階段 ， 大大影響了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度 ， 完全不符合批量生產(chǎn)結(jié)構(gòu)的要求 。 晶體到達(dá)同步輻射實(shí)驗(yàn)室 ， 又需要將晶體安裝到測角頭上并調(diào)試到衍射儀上 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 衍射數(shù)據(jù)收集的全自動化考慮 用于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究的晶體量很大 ， 它們無一例外地要送到同步加速器輻射實(shí)驗(yàn)室去 。 回?cái)[運(yùn)動實(shí)際上是晶體在測角頭上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)的運(yùn)動 ， 探測器面板垂于入射線在晶體的后方 ， 與晶體的距離可調(diào) 。 為了給衍射方向指標(biāo)化 ， 使用了部分反射點(diǎn)的信息 ， 即一個衍射斑點(diǎn)被分成兩半 ，分別落在相鄰的兩個圖像的相應(yīng)位臵上 。 ~3176。 回?cái)[法又稱無層線屏周轉(zhuǎn)法 ， 其特點(diǎn)是同時收集衍射空間的三維數(shù)據(jù) 。 記錄裝臵的運(yùn)動方式中最重要的一種方式為 回?cái)[法 。 無論四圓衍射儀還是多絲面探側(cè)器都可以在程序帶動下完成對一個未知晶體的空間群等初步晶體學(xué)參數(shù)的鑒定 ， 并隨后收集到它的全部衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù) ， 是 自動化很高的數(shù)據(jù)收集儀 。 同時 ，晶體耐受輻射的時間有限 ， 為了收集一套完整的數(shù)據(jù)就需要多次更換晶體 ， 從而引入誤差降低數(shù)據(jù)的精度。 因此 ， 四圓衍射儀是采用逐點(diǎn)收集數(shù)據(jù)方式的全自動衍射數(shù)據(jù)收集儀器 ， 它的優(yōu)缺點(diǎn)正好和底片相反 。 四圓中的 3 個圓是調(diào)節(jié)晶體方位的 ， 另一個圓在水平平面上調(diào)節(jié)計(jì)數(shù)管方位 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 使用計(jì)數(shù)管記錄衍射線強(qiáng)度的裝臵主要是四圓衍射儀 。 這兩種相機(jī)都要使用層線屏將外層衍射線擋住 ， 只收取一層內(nèi)的衍射數(shù)據(jù) ， 所以效率低 。 這是 20 世紀(jì) 80 年代以前主要用來收集蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的方法 。 按 記錄裝臵的運(yùn)動方式 分 ， 又有外森堡相機(jī) 、 徘循相機(jī) 、 回?cái)[相機(jī) 、 四圓衍射儀等之分 。 陽極靶式 X 光機(jī)沒有這個優(yōu)點(diǎn) 。 它的輻射功率集中于電子軌道平面附近在沿電子前進(jìn)方向兩側(cè)半張角的一毫弧內(nèi) ， 這個范圍內(nèi)集中了輻射功率的 85%， 因此， 它可以在幾十米外得到高通量的光源 。 對同一晶體來說 ， 只要蛋白質(zhì)對輻射有一定的耐受力 （否則在收數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)過程中需要更換晶體 ） , X 射線源的強(qiáng)度越高 ， 晶體的衍射線強(qiáng)度也就越大 ， 衍射線強(qiáng)度越大 ， 數(shù)據(jù)誤差就越小 。 收集低溫冷凍的晶體不使用毛細(xì)管而是使用特殊的小圓環(huán) ， 將晶體連同母液用這個小圓環(huán)取出來 ， 然后迅速臵于液氮中冷凍 。 蛋白質(zhì)晶體的收集有一整套手工操作的程序 ， 需要經(jīng)過一定的訓(xùn)練方可掌握 。 這也是為什么蛋白質(zhì)晶體在收集數(shù)據(jù)前要首先密封于一種特殊的毛細(xì)管中的原因 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 1 晶體的收集和處理 蛋白質(zhì)晶體暴露于空氣中將解體 ， 這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)晶體中含水量相當(dāng)高 （ 20％ ~70% ） 。 所以 ， 層層把關(guān)是必要的 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 首先要充分了解到 ， 一套好的衍射數(shù)據(jù)是晶體結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ) ， 衍射數(shù)據(jù)的好壞直接涉及結(jié)果的精度 。 還可以使用染料甲基藍(lán)等鑒別 ， 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)晶體吸收染料的能力極強(qiáng) 。 用濕濾紙觸碰 ， 蛋白質(zhì)粉末會很決溶解；而小分子晶體則溶解很慢 。 在低倍光學(xué)顯微鏡下使用針來觸碰微晶 ， 可以感到小分子晶體偏硬 ， 容易碎成兩半或幾瓣；蛋白質(zhì)晶體偏軟 ， 容易碎成粉 。 以下提到的一些方法對鑒別蛋白質(zhì)微晶或許會有幫助 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 5 蛋白質(zhì)晶體的鑒定 在某些情況下 ， 在蛋白質(zhì)晶體生長過程中 ， 會長出鹽或某些沉淀劑的晶體 ， 這需要小心加以鑒別 ， 特別是在微晶狀態(tài)下 。貯液槽中的溶液在實(shí)驗(yàn)過程中可調(diào) ， 懸滴的量又可以很小 ， 這些都是這個方法的優(yōu)點(diǎn) ， 所以該方法是晶體生長的最常用方法。 由于鹽濃度不同 ， 造成懸滴和貯液槽之間的水蒸氣壓力的不同 ， 從而發(fā)生水蒸氣的交換 ， 使懸滴中蛋白質(zhì)濃度逐步變濃 ， 從而達(dá)到蛋白質(zhì)緩慢的過飽和 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 最常用的方法當(dāng)屬 懸滴法 。晶體將從預(yù)先配臵好的過飽和溶液中緩慢生長 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 最簡單的方法是 分批靜臵法 （ batch method ） 。 但是震動問題不易控制 ， 因此失敗的例子也不少 ， 這也說明了防震的重要性 。一般要在水泥臺上進(jìn)行實(shí)驗(yàn) ， 同時不要因?yàn)樾约倍３Ｓ^察 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 震動因素也是一個需要考慮的重耍問題 。 溫度的變化會造成蛋白質(zhì)溶液過飽和的擾動 ， 改變蛋白質(zhì)的溶解度 ， 這都是對大晶體生長非常不利的 。 一般情況下 ， 蛋白質(zhì)皆不能耐受高溫 ， 大多數(shù)蛋白質(zhì)在 60~70℃ 下要變性 ， 有些蛋白質(zhì)只有在低溫下才能保持其活力 。 在生物化學(xué)條件合適的情況下 ， 往往就可以得到微晶 ， 物理?xiàng)l件掌握得好 ，才可以獲得大的單晶 ， 因?yàn)槲锢項(xiàng)l件控制了晶核形成的速度和晶體生長的速度 。 比如 ， 是配制蛋白質(zhì)的過飽和清液還是使沉淀的蛋白質(zhì)緩慢溶于飽和蛋白質(zhì)溶液中 ？ 比如 ， 蛋白質(zhì)無定形沉淀的回收和再使用 …… 都是值得探討的問題 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在摸索晶體生長的過程中 ， 首先是緩沖液的選取 ， 其次是沉淀劑 ， 然后是蛋白質(zhì)濃度 ， 對有些蛋白質(zhì)來說 ， 還要考慮到使用特殊的金屬離子 、 防氧化劑 、 防腐劑 ， 甚至底物和輔酶等 ， 余下的就是經(jīng)驗(yàn)了 。 如果這個過程發(fā)展得太快 ， 盡管晶體生長的條件已經(jīng)滿足 ， 蛋白質(zhì)還是完全有可能以 無定 形狀態(tài)或 微晶 從溶液中析出 。 在純化的最后階段 ， 一旦溶液中的蛋白質(zhì)達(dá)到了溶解度最小的條件 , 同時蛋白質(zhì)溶液達(dá)到過飽和的時候 ， 蛋白質(zhì)在溶液中是處于亞穩(wěn)態(tài) ， 蛋白質(zhì)就能成核并形成晶體 ， 從溶液中析出 。 蛋白質(zhì)晶體生長的生化條件主要是指 pH 值 、 離子強(qiáng)度 、 沉淀劑和添加劑 （ 如有機(jī)溶劑 、 鹽或去垢劑 ） 的濃度等因素 。 使用樣品一般應(yīng)在低溫狀態(tài)下操作 ， 若發(fā)現(xiàn)有純度問題就要小心鑒定 ， 最后很可能不得不使用高壓液相層析 （HPLC ） 來分析 ， 甚至分離 。 1 對原材料的要求 ③ 在拿到樣品之后 ， 最好是 做一個等電聚焦 ， 考察一下是否是一條帶 ， 若不是就要小心了 。 同時 ， 還要對樣品中的內(nèi)含物做到心中有數(shù) ， 特別是金屬離子 ， 需要了解清楚 。 構(gòu)成原料的微觀不均一性的某些方面對某些生物化學(xué)研究可能是不重要的 ， 但直接影響到大的單晶的形成 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長是影響結(jié)構(gòu)分析速度的重要階段 。 ② 晶體生長并經(jīng)冷凍技術(shù)處理； ③ 重原子衍生物制備； ④ 衍射數(shù)據(jù)收集； ⑤ 衍射數(shù)據(jù)分析和改進(jìn)； ⑥ 獲得最后的結(jié)構(gòu)模型 （ 包括修正 ） 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì) X 射線晶體結(jié)構(gòu)測定的基本過程 ① 經(jīng)基因克隆 、 表達(dá)后所生成的蛋白質(zhì)提純 。 這樣一來 ， 就可使晶體結(jié)構(gòu)分析的過程大大簡化到猶如操作一臺普通的光學(xué)顯微鏡 ， 甚至達(dá)到使中學(xué)生也可以使用的程度 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 反過來 ， 基因功能研究的需要 ， 又要求快速 、 準(zhǔn)確 、 系統(tǒng)地測定每一個基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) ， 目前人們也只是掌握了其中的 1％ ~2％ 而已 。該學(xué)科是以生命物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的運(yùn)動性為基礎(chǔ)來闡明生命活動本質(zhì)的一門學(xué)科 ， 特別是在人體基因組定位之后 ， 又發(fā)展成為 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)或稱結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)學(xué)， 其目的就是獲得全部蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 。 目前 ， 時間的分辨已可達(dá)到納秒的水平 。 這些復(fù)合物有上百納米的大晶胞 ， 使衍射數(shù)據(jù)量達(dá)到天文數(shù)字 。 在現(xiàn)階段 ， 由于儀器技術(shù)和方法的不斷改進(jìn) ， 以前測定一個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)需要以年計(jì)算 ， 而現(xiàn)在可能只需要以天計(jì)算了 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 科學(xué)的發(fā)展正使人們發(fā)現(xiàn)一些更簡單的方法最終可以直接看到復(fù)雜的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 。 這樣說來 ， X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析和光學(xué)顯微鏡應(yīng)該有大致類似的物理學(xué)原理 ， 所不同的是人們找不到一個透鏡來聚焦 X射線 ， 所以必須 通過富里哀加和來重現(xiàn)電子密度 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 最后 ， 對 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的基本原理和光學(xué)顯微鏡的成像原理作一個簡單的類比 。 用于小分子晶體生長的簡單蒸發(fā)過飽和法不適用于蛋白質(zhì)晶體的生長 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析方法沒有突破以前 ， 培養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體當(dāng)然不是個主要問題 。 所以 X 射線衍射儀 、 轉(zhuǎn)靶 X 光機(jī) 、 細(xì)聚焦 X 光管 、多絲面探測器 、 圖像板 （ image plate ） 、 同步加速器輻射 …… 都應(yīng)運(yùn)而生了 。早期的 X光機(jī)功率低 ， 無論是封閉管式還是可拆式 ，X 光能量都很低 。 利用引進(jìn)的重原子所造成的衍射線強(qiáng)度的差別 ， 使用帕特森函數(shù)就有可能推出位相信息 。 所謂重原子 ， 就是元素周期表中 碘原子 以上的原子 ， 相對于構(gòu)成蛋白質(zhì)的碳 、 氮 、 氧原子來說它們就是重原子 。 他們使用了相同的方法 ― 同晶臵換法 ，并因此而獲得了 1962 年的諾貝爾獎金 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 佩魯茨 （ Perutz ） 曾于 1937 年將血紅蛋白的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析作為他的博士論文 ， 但他完成 血紅蛋白 的 nm 分辨率的晶體結(jié)構(gòu)是 1959 年 ， 這是第二個問世的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu) 。 5 天然和重組蛋白質(zhì) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析的特殊性 早在 1830 年就有了血紅蛋白晶體 ， 而且直到 X射線晶體學(xué)問世 (1930年前后 )， 蛋