【正文】 產(chǎn)生ESBLs的細菌主要是大腸埃希氏菌、肺炎克雷白氏菌、陰溝腸桿菌，其他如銅綠假單胞菌、變形桿菌屬及不動桿菌屬也可產(chǎn)生。（3）結(jié)果判斷：頭孢西丁紙片法：金黃色葡萄球菌抑菌環(huán)≥20mm為敏感，≤19 mm為耐藥；凝固酶陰性葡萄球菌≥25 mm為敏感，≤24 mm為耐藥。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)因多了一個由mecＡ基因編碼的青霉素結(jié)合蛋白（PBP2α）而對甲氧西林耐藥?？紤]到抗菌藥物的效力，不同藥物應(yīng)選擇不同的稀釋度。3）細菌接種：將已準備好的菌液分別加入到上述各試驗管和對照管中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻。標準菌株應(yīng)每周用MH瓊脂傳代，4℃保存。（3）菌液濃度也可影響試驗的結(jié)果，濃度大細菌多時抑菌環(huán)減?。痪可贂r抑菌環(huán)則偏大。3．結(jié)果觀察和報告將平板置于黑背景的明亮處，用卡尺從背面精確測量包括紙片直徑在內(nèi)的抑菌環(huán)直徑，測得結(jié)果以毫米為單位進行記錄，最后參照NCCLS的標準（見附錄）進行結(jié)果判斷，并以敏感（sensitivity）、中度敏感（morderate sensitivity）和耐藥（resistant）等程度報告之。瓊脂厚為4mm（約23~25ml培養(yǎng)基），瓊脂凝固后塑料包裝放4℃保存，在5日內(nèi)用完，使用前應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱放置30min使表面干燥。4. %麥氏比濁管 配制方法如下： BaCl2 (% W/V BaCl2 . 2H2O) H2SO4 (1%, V/V) 將二液置冰水浴中冷卻后混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。3）將3個平板同時放置紫外燈下，打開蓋子，讓紫外燈照射30min。將滴加細菌芽胞的紙條、鋁片等載體，放置于滅菌器的不同位置，滅菌后，取出試紙條，接種于溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置55～60℃溫箱中培養(yǎng)48h至7天觀察結(jié)果，根據(jù)紙片中芽孢死亡與否來判斷是否達到滅菌要求。5）滅菌結(jié)束時，不應(yīng)立即放氣，而應(yīng)停止加熱使其自然冷卻 20~30min，使鍋內(nèi)壓力下降至零位（壓力表指針回到零位）后數(shù)分鐘，將放汽閥打開，然后略微打開鍋蓋（開一條縫），人離開消毒室，待其自然冷卻到一定程度再將物品取出。3）結(jié)束 時間到后，關(guān)掉電源，停止加熱，讓滅菌鍋內(nèi)壓力自然下降。工作原理：在一密閉的容器內(nèi)對水加熱，產(chǎn)生熱蒸汽，蒸汽的增多使滅菌器內(nèi)的壓力增高，壓力增高繼而又使水的溫度增高。物品放置在箱內(nèi)的金屬架上，既可以滅菌也可以干烤。（3）將培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。2）倒入的培養(yǎng)基溫度大約在45℃左右（熱而不燙手為宜），太熱，太冷都不行?！緦嶒瀮?nèi)容】一、細菌分布檢測1．空氣細菌檢查（1）方法：取普通平板（或血平板）1個，選室內(nèi)或室外的一處空間，在離地面1m左右高度的桌面（或臺面）上，打開平板蓋，讓培養(yǎng)基暴露于空氣中，10min之后，迅速蓋好蓋子，在底部寫上標記，放35℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果記錄和報告】實驗六 細菌的分布及消毒滅菌【目的和要求】，幫助建立無菌觀念。在有分子氧存在的情況下，氧化酶先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C使試劑對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物（靛酚藍）。臨床應(yīng)用：主要用于腸道桿菌的鑒別，產(chǎn)氣腸桿菌、沙門菌屬、克雷伯菌屬為陽性，大腸埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬為陰性。（2）方法：將待測細菌穿刺接種于含硫酸亞鐵（或醋酸鉛）的半固體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24~48小時后觀察結(jié)果。臨床應(yīng)用：主要用于產(chǎn)氣腸桿菌和大腸埃希菌的鑒別，產(chǎn)氣腸桿菌VP試驗陽性，后者為陰性。（2）方法：1）用接種環(huán)挑取大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于葡萄糖蛋白胨水中，置35℃培養(yǎng)箱，經(jīng)18~24h培養(yǎng)。 （3）結(jié)果觀察：培養(yǎng)基變紅者為細菌產(chǎn)酸，半固體中有氣泡即產(chǎn)氣?！緦嶒瀮?nèi)容】不同細菌具有不同的酶，對同一種基質(zhì)（糖、蛋白質(zhì)等）分解代謝的能力不同而可得到不同的代謝產(chǎn)物，檢查這些代謝產(chǎn)物就可幫助鑒別細菌，這類試驗稱為細菌的生化反應(yīng)。菌落性狀的描述：大小、形狀、顏色、凸扁、表面光滑度、濕潤度、光澤、透明度、邊緣、粘度、溶血（血平板）、氣味等。觀察要點：注意觀察培養(yǎng)基的透明度、管底和液面上是否有細菌生長。（6）厭氧手套箱培養(yǎng)法：厭氧手套箱是目前國際上公認的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之一。立即將氣體發(fā)生袋放入罐內(nèi)，密封罐蓋，使氣體釋放到罐中。3．微需氧培養(yǎng)：先用真空泵將容器內(nèi)的空氣排盡，再注入5%O10%CO85%N2的混合氣體，然后置于35℃培養(yǎng)箱孵育后觀察結(jié)果。將接種后的培養(yǎng)基（試管放試管架上，平板底上蓋下）置35℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1824h。（4）取菌時注意菌落不要取得太多，應(yīng)蘸取而不宜刮取，否則平板劃線很難分離出單個菌落。蓋上平板蓋，置室溫放置5min使平板表面稍干，然后用無菌鑷子將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，或向豎在平板表面的牛津小杯內(nèi)加入不同濃度的藥物，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果，測定抑菌圈直徑，按判斷標準判定結(jié)果。（1）將接種環(huán)（或接種針）在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后以無菌操作挑取少許菌落。3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。方法：（圖43）（1）先將接種針在火焰上燒灼滅菌，待冷卻后挑取少許菌落。主要用于液體標本涂布接種?！緦嶒瀮?nèi)容】一、細菌的接種工具1．接種環(huán)和接種針：其結(jié)構(gòu)包括環(huán)（針）、金屬柄、絕緣柄三部分（見圖41）。（3）滅菌后的培養(yǎng)基在進行分裝時應(yīng)注意無菌操作，傾注平板時培養(yǎng)基的溫度不能過高，否則冷凝水多，影響細菌的分離并易造成污染；也不能溫度過低，否則瓊脂過早凝固，使平板表面高低不平。5）過濾除菌：用于血清、細胞培養(yǎng)液的滅菌。2）瓊脂斜面：分裝于試管，分裝量約為試管高度的1/4~1/3，滅菌后趁熱放置成斜面，斜面長度占試管長度的2/3左右，斜面下方保持1cm高。4 2 3 1 目測方向圖31 比色法若測定管偏酸或偏堿，、直到測定管的顏色與標準管相同為止，注意：在加酸或加堿矯正時要緩慢，并準確記錄加入的量，按下式計算培養(yǎng)基中需加入的量。1．培養(yǎng)基配制的基本程序包括：調(diào)配、溶化、矯正pH、過濾澄清、分裝、滅菌、鑒定等幾個主要步驟。（2）滅菌上述玻璃器材可用高壓蒸汽滅菌法，也可用干烤法進行滅菌。5）注射器：用后若無病原微生物污染，立即用自來水將注射器及針頭等抽洗干凈；若有病原微生物污染，則立即進行煮沸消毒（含有芽胞菌，則應(yīng)用高壓蒸汽滅菌）。2．器材：試管、吸管、平皿、錐形瓶、量筒、吸管、精密PH試紙、天平、濾紙等。取一環(huán)菌液于蓋玻片中央，將凹玻片凹窩對準蓋玻片上的菌液，迅速翻轉(zhuǎn)載玻片，用小鑷子輕壓蓋玻片，使之與凹玻片粘緊封閉（見圖21），置顯微鏡下觀察。5．異染顆粒染色細菌經(jīng)涂片、干燥、固定，加甲液（見附錄二）染色3~5min，水洗后加乙液染色1min，水洗，待干、鏡檢。2）滴加結(jié)晶紫染液，在火焰上微微加熱至染液冒蒸氣為止。結(jié)果：鞭毛染成紅色。培養(yǎng)基應(yīng)為營養(yǎng)較好的瓊脂平板（如血平板、營養(yǎng)瓊脂），不可用含抑制劑的選擇培養(yǎng)基（如SS、中國藍、MAC等）。（5）因細菌的菌齡不同染色結(jié)果也有差異，一般以18~24h培養(yǎng)物染色結(jié)果最好。（3）固定：干燥后的標本片在酒精燈火焰上來回通過3次（以鐘擺的速度），冷卻后染色。大部分細菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇不同的染色方法，在實際工作中，應(yīng)用最廣泛的是革蘭染色法。2．掌握革蘭染色的方法、原理、結(jié)果觀察及意義。四、熒光顯微鏡1．構(gòu)造：（1）熒光顯微鏡光源：能發(fā)射豐富的紫外線光和紫蘭光，常用150~200瓦高壓汞燈。三、暗視野顯微鏡1．構(gòu)造與原理：在顯微鏡上安裝一個特制的聚光器一暗視野聚光器。（2）顯微鏡放到實驗臺上時，先放鏡座的一端，再將鏡座全部放穩(wěn)，切不可使鏡座全面同時與臺面接觸，這樣震動過大，透鏡和微調(diào)節(jié)器的裝置易損壞。當用低倍鏡或高倍鏡觀察時，應(yīng)適當縮小光圈，下降聚光器；當用油鏡觀察時，光線宜強，應(yīng)把光圈完全打開，并將聚光器上升到最高位置。圖11 光學顯微鏡的構(gòu)造顯微鏡的接物鏡有低倍鏡、高倍鏡、油鏡三種，放大倍數(shù)依次增高，其識別方法為：（1）低倍鏡：鏡頭標志為10或10/，鏡頭最短，其上?？逃悬S色環(huán)圈。第一章 微生物學檢驗基本技術(shù)實驗一 細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及顯微鏡油鏡的使用【目的和要求】1．熟悉微生物實驗室規(guī)則并自覺遵守。3．實驗室生物安全管理制度實驗室生物安全制度建設(shè)對于臨床實驗室而言是生物安全防護的核心，實驗室生物安全管理制度應(yīng)包括：實驗室準入制度、生物安全培訓制度、生物安全責任制和責任追究制度、生物防護與安全制度、安全檢查制度、個人防護制度、實驗室管理制度、清潔消毒制度、安全計劃審核制度、廢棄物處理制度、事故報告制度、生物安全防護應(yīng)急預(yù)案、標準操作程序等。（5）實驗臺面應(yīng)能防水、耐腐蝕、耐熱。三級生物安全防護實驗室（BSL3）適用于有明顯危害、可以通過空氣傳播的病原微生物（如結(jié)核桿菌、伯氏立克次體等），通常已有預(yù)防傳染的疫苗，該級別實驗室除了有嚴格的一級和二級安全設(shè)施要求外，還需具備合適的空氣凈化系統(tǒng)。（5）菌液污染環(huán)境：將適量2~3%%新潔爾滅浸泡污染面半小時后除去，如手上有菌污染，也可浸泡于上述消毒液中3~5min，之后用肥皂和清水洗凈。禁止將本實驗室的物品帶出實驗室外。因此，實驗中應(yīng)嚴格遵守實驗規(guī)則，建立無菌觀念，嚴格無菌操作，防止實驗過程中出現(xiàn)意外情況，并確保實驗結(jié)果的準確。3．通過實驗進一步掌握臨床常見病原微生物的生物學性狀、分離培養(yǎng)和鑒定的方法、各種臨床標本的微生物學檢驗程序和方法。不準在實驗室內(nèi)吸煙、飲水和進食，盡量避免用手觸摸頭、面部，防止感染，盡量減少室內(nèi)活動，以免引起風動。（2）化學藥品腐蝕傷：若為強酸，用大量清水沖洗后再以5%碳酸氫鈉溶液中和；若為強堿，用大量清水沖洗后再以5%醋酸或5%硼酸溶液中和；若受傷處是眼部，經(jīng)上述方法處理后，再滴入橄欖油或液體石蠟1~2滴。2．生物安全實驗室分級與要求由于各種病原微生物的危險度等級不同，因此實驗室必須達到相應(yīng)的生物防護等級才能開展有關(guān)實驗。（2）每個實驗室均應(yīng)設(shè)置洗手池，宜設(shè)置在靠近出口處。（9）有可靠的電力供應(yīng)和應(yīng)急照明。實驗室管理者應(yīng)對實驗室的風險級別進行分析，尤其對風險級別較高的、接觸高危標本幾率較大的區(qū)域如微生物和分子生物學室予以高度重視，保護實驗室工作人員和環(huán)境的安全?！緦嶒瀮?nèi)容】一、細菌基本形態(tài)和特殊構(gòu)造的觀察1．細菌的基本形態(tài)（各種球菌、桿菌、弧菌等）觀察要點：注意細菌的染色性、相對大小、形狀及排列方式。 3．使用方法（1）采光：使用顯微鏡時必須端坐，將顯微鏡放在胸前適當位置。觀察時應(yīng)將兩只眼睛同時睜開，左眼觀察，右眼用于繪圖或記錄。（6）鏡頭必須保持清潔，油鏡使用完后應(yīng)立即用擦鏡紙拭去香柏油。2．使用方法：（1）將顯微鏡聚光器御下，裝上暗視野聚光器，置暗室，使用人工光源。3．注意事項（1）熒光顯微鏡如用高壓汞燈作光源，使用時一經(jīng)開啟不宜中斷，斷電后需待汞燈冷卻后（約15min）方能再啟用。3．其他：載玻片、接種環(huán)、酒精燈、顯微鏡、香柏油、蠟筆、擦鏡紙、脫油劑等。2．方法 （1）涂片：取清潔無油跡的載玻片1張，用蠟筆劃線將其分成左右兩格。（2）脫色時間長短要適宜，如果涂片較厚應(yīng)相應(yīng)的延長脫色時間，如涂片較薄則相應(yīng)的縮短脫色時間，脫色時應(yīng)不斷旋轉(zhuǎn)玻片搖勻，使其充分脫色，通常脫到乙醇中沒有紫色流下即可。（3）滴加5g/L龍膽紫染色3~5min，水洗，待干、鏡檢。（4）滴加染液（配方見附錄二），染色約10~15min后，將玻片微傾斜，用蒸餾水緩慢滴加在玻片頂端無菌膜處洗去染液，注意洗凈染液表面的金屬光澤液膜。3）復染：用堿性美藍染1min，水洗，待干、鏡檢。3），水洗。用小鑷子挾一蓋玻片，先使蓋玻片一邊接觸菌液，然后緩緩放下，覆蓋于菌液上，避免菌液中產(chǎn)生氣泡。2．熟悉培養(yǎng)基的種類、主要成分及用途。 2）試管：作血清反應(yīng)的試管若不含病原微生物，可先用5％熱肥皂水刷洗，再用自來水沖洗；若不夠清潔，可先用清潔液（配制法見附錄二）浸泡數(shù)小時，然后用自來水沖洗7次以上，晾干備用。若是盛有液體培養(yǎng)基的試管，應(yīng)直立并扎成捆，以免滅菌時傾倒。按照物理性狀分為：液體、半固體和固體培養(yǎng)基三類，其區(qū)別主要是凝固劑的有無和多少；按用途分為：基礎(chǔ)、營養(yǎng)、選擇、鑒別、增菌、特殊培養(yǎng)基等。比色法：取3支與標準管口徑相同的試管，按下表加樣。（5）分裝　根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同的容器中，并進行包扎。2）間歇滅菌法：用于含糖、明膠、血清、牛乳、雞蛋等不耐高溫物質(zhì)配制的培養(yǎng)基滅菌。裝培養(yǎng)基的容器不能用鐵、銅等材質(zhì)的容器，若鐵進入培養(yǎng)基中，；?！驹噭┡c器材】1．菌種：葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌等。 接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的接種，接種針用于半固體培養(yǎng)基的接種。（4）將試管口滅菌后加塞，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。2）左手斜持平板，用手掌托著平板底部，五指固定平板邊緣，在酒精燈旁以拇指、食指和中指將平板蓋撐開大約30~45176。3）劃線完畢，將平板扣入平板蓋，接種環(huán)燒灼滅菌后放回原處。（1）活菌計數(shù)：，用無菌L型玻璃棒將液滴涂布均勻，蓋上平板蓋，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后計數(shù)菌落，則每毫升所含活菌數(shù)=菌落數(shù)10稀釋倍數(shù)。操作時不宜說話或?qū)⒖诒强拷囵B(yǎng)基表面，以免呼吸道排出的細菌污染培養(yǎng)基。廢棄的有菌材料（如玻片、有菌的平板、試管、吸管等）均需滅菌后再清洗。隨著缸內(nèi)蠟燭燃燒產(chǎn)生的CO2增加，蠟燭逐漸自行熄滅，此時缸內(nèi)的CO2濃度約為5~10%，置35℃培養(yǎng)箱孵育18~24h后觀察結(jié)果。（750mm