【正文】 酶、核糖核酸酶等。,烷基氨玻璃用對(duì)硝基苯酚氯處理(chǔlǐ)后，再還原，轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷慊苌?,第三十五頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。h233。h233。,溴化氰—亞胺碳酸基反應(yīng)(fǎny236。,溴化氰法的優(yōu)缺點(diǎn): 優(yōu)點(diǎn): 適用于多種載體的活化,不僅是多糖類,而且也適用于許多其他合成的含羥基的聚合物. 其活化的載體可用于偶聯(lián)小配基,以及含伯氨基的高分子 聚合物 操作簡(jiǎn)單重復(fù)性好. 用于酶的固定條件特別溫和. 缺點(diǎn): 少量的持續(xù)不斷的配基的脫落(tuōlu242。n)成濕餅狀并轉(zhuǎn)移到500ml燒環(huán)中。 五，疊氮反應(yīng)：適用于含羥基，羧甲基等的載體，如CM纖維素，葡聚糖，聚氨基酸等，可在酸等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮衍生物，然后在pH7.58.5和酶的氨基直接偶聯(lián)。,七,酸酐反應(yīng):乙烯等和順丁烯二酸酐的共聚物，可通過(guò)其活潑的酸酐基直接和酶的氨基偶聯(lián)，生成固定化酶。 十，直接法或涂層法,第四十四頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。 參與交聯(lián)的基團(tuán)有: a氨基,?NH2（Lys）, SH(cys),咪唑基(His),酚基（Tyr),等,第四十五頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。一般而言：低酶濃度下主要形成分子內(nèi)交聯(lián)，交聯(lián)后的酶仍呈溶解狀態(tài)；高濃度下分子間交聯(lián)增加，形成的固定化酶往往變?yōu)椴蝗軕B(tài)。,第四十七頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。或添加惰性蛋白。,通常采用惰性材料(c225。 缺點(diǎn)：包埋時(shí)可能發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)使酶失活，只適合小分子(fēnzǐ)底物和產(chǎn)物，不適合大分子底物和產(chǎn)物。 合成高分子化合物包埋通常采用單體或預(yù)聚物在酶或微生物存在下聚合的方法；對(duì)天然高分子化合物則采用于溶膠(r243。r其顆粒比網(wǎng)格型小得多，有利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，但是反應(yīng)條件要求高，制備成本(ch233。 特點(diǎn)：一定的機(jī)械性能，能定向?qū)⒚傅劝镔|(zhì)攜帶到一定部位然后釋放，具有更大的定向性；比較安全，回收率高。nt237。)2,如何提高分散法固定化酶的催化效率? 吸附法固定酶,離子交換法固定化酶? 離子交換法所采用的載體應(yīng)該帶有與蛋白質(zhì)相反的電荷?pI6.5的酶在pH8.3環(huán)境中應(yīng)該與什么載體結(jié)合(DEAE或CM纖維素?) 可以進(jìn)行共價(jià)固定化的載體基團(tuán)主要(zhǔy224。)3,共價(jià)固定化就是將酶直接通過(guò)某種方式共價(jià)連接到載體的功能基團(tuán)(jī tu225。)4,異硫氰酸法是針對(duì)什么基團(tuán)的載體(z224。)5,包埋法屬于共價(jià)還是非共價(jià)固定化?有什么優(yōu)劣(yōu li232。),酶的性質(zhì)(x236。 原因可能有： 固定化過(guò)程中，酶分子空間構(gòu)象會(huì)有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸； 固定化后，酶分子空間自由度受到限制（空間位阻），影響到活性中心與底物的定位作用； 內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心接近受阻(sh242。nt237。)固定化后其穩(wěn)定性都有所提高； 表現(xiàn)在：熱穩(wěn)定性提高；對(duì)各種有機(jī)試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高；對(duì)不同pH穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性都有影響。),固定化后酶的活力上升(sh224。)固定化后酶的熱穩(wěn)定性提高，因此其最適溫度也提高了，這對(duì)于生產(chǎn)上非常有利。),固定化后酶的最適溫度(wēnd249。ng)發(fā)生偏離,主要是微環(huán)境表面 的電荷性質(zhì)的影響.,如何(r,（五）固定化酶的米氏常數(shù)(Km)的變化: 固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km值隨載體的帶電性能變化. 當(dāng)酶結(jié)合于中性載體時(shí),由于擴(kuò)散限制造成表觀Km值的上升。(一定降低嗎?) 而載體電荷與底物相同,就會(huì)造成固定化酶的表觀Km值顯著增加.,第六十八頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。ngzh236。)發(fā)生變化的原因：,固定化改變了酶的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象； 固定化后酶催化反應(yīng)的空間障礙、擴(kuò)散限制效應(yīng)(xi224。,五.影響(yǐngxiǎng)固定化酶性能的因素:,包括：質(zhì)量傳遞效應(yīng)和支持物產(chǎn)生的（靜態(tài)(j236。li224。,第七十二頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。動(dòng)態(tài)質(zhì)子梯度對(duì)固定化酶催化(cuī hu224。y)問(wèn)題,概念:固定化。包埋法 為什么要進(jìn)行酶的固定化? 固定化酶有什么優(yōu)缺點(diǎn)(相對(duì)(xiāngdu236。u),選擇性?溴化氰法的基本過(guò)程. 什么叫溴化氰法？其原理是什么？其應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)？舉例說(shuō)明一個(gè)典型利用溴化氰法進(jìn)行共價(jià)固定的實(shí)驗(yàn)。i)的固定化,一、輔酶的定義及分類： 輔因子:有些酶的催化作用必須在一些非蛋白質(zhì)成分的物質(zhì)(w249。i)要固定化?,酶的作用往往需要輔酶 輔酶一般價(jià)格比較昂貴 輔酶不容易(r243。nt237。,二、載體(z224。 常用共價(jià)偶聯(lián)法固定化輔酶或輔基，一般采用溴化氰法、碳亞二胺法以及重氮偶聯(lián)法。)合適的載體； 2．其次，選擇合適的間隔臂； 3．引入適當(dāng)?shù)墓δ芑鶊F(tuán)或利用輔基本身合適的功能基團(tuán)將輔基偶聯(lián)到載體上。 NAD+通過(guò)通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)法在瓊脂糖上的固定化步驟： 用碘乙酸使NAD+/NADH腺嘌呤中的1位氮原子烷基化。 通過(guò)碳二亞胺法使長(zhǎng)鏈接臂分子已二胺1,6與NAD+衍生物的羧基偶聯(lián)。,溴化氰法,活化載體(z224。x237。bāo)的固定化,固定化細(xì)胞就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留(bǎoli)了細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)的天然環(huán)境，因而更加穩(wěn)定； 固定化細(xì)胞保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，這對(duì)于多步催化轉(zhuǎn)換，其優(yōu)勢(shì)更加明顯； 無(wú)需輔酶的再生。)多酶 反應(yīng),環(huán)境(hu225。o)的副產(chǎn)物； 細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用，載體形成的孔隙大小影響底物分子的通透性。 固定化生長(zhǎng)細(xì)胞（固定化增殖細(xì)胞）：是將活細(xì)胞固定化在載體上使其在連續(xù)反應(yīng)過(guò)程中保持旺盛的生長(zhǎng)、繁殖能力的一種固定化方法。,固定化增殖(zēngzh237。nɡ)或不規(guī)則狀。bāo)的制備：,固定化細(xì)胞和固定化酶的制備方法基本相同。)保留和操作的穩(wěn)定性是固定化生物催化劑的評(píng)價(jià)先決條件.,第九十四頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。,復(fù)習(xí)(f249。,第五節(jié) 固定化酶和固定化細(xì)胞(x236。ng)的改進(jìn)之后才能用于固定化酶的測(cè)定。ng),過(guò)濾后按常規(guī)進(jìn)行測(cè)定.此法簡(jiǎn)單,但受反應(yīng)器形狀、大小及反應(yīng)液量影響，必須固定條件下測(cè)定；盡可能在達(dá)到最高反應(yīng)速度的振蕩或攪拌條件下進(jìn)行。,第五節(jié) 固定化酶和固定化細(xì)胞(x236。bāo)的表征,3.固定化酶(細(xì)胞)的半衰期 固定化酶(細(xì)胞)在連續(xù)測(cè)定條件下,活力下降為最初活力一半時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間,稱為半衰期. 半衰期是衡量(h233。bāo)的表征,二、載體活化程度和固定化配基密度的測(cè)定 （一）活化程度的測(cè)定： 常用茚三酮法測(cè)定載體活化的程度：茚三酮與伯胺反應(yīng)生成一種帶色的復(fù)合物，叫赫曼紫，這種反應(yīng)能用于測(cè)量結(jié)合(ji233。,第五節(jié) 固定化酶和固定化細(xì)胞(x236。,第五節(jié) 固定化酶和固定化細(xì)胞(x236。,第一百零三頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。ng)團(tuán)能還原Cu 2+到Cu+，可與雙辛可寧酸顯色。ngli224。,第六節(jié) 固定化酶與固定化細(xì)胞(x236。,第六節(jié) 固定化酶與固定化細(xì)胞(x236。 利用合適的多克隆抗體進(jìn)行蛋白酶的固定 分離伴刀豆蛋白A(Con A)所用的生物親和吸附劑的制備 利用抗鼠蛋白中特定的Fc進(jìn)行固定.,第一百零七頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。nɡ)固定: 利用硼酸鹽親和凝膠定向固定 利用金屬絡(luò)合物的定向固定 生物素親和素系統(tǒng) 利用定點(diǎn)誘變實(shí)現(xiàn)蛋白定位吸附,第一百零八頁(yè)，共一百一十四頁(yè)。)研究：將細(xì)胞表面抗原分子對(duì)應(yīng)地抗體偶聯(lián)于載體上。d224。 脂質(zhì)體。ngy242。 提高基因工程(jīyīn gōngch233。,復(fù)習(xí)(f249。,內(nèi)容(n232。ng)的持續(xù)不斷的配基的脫落。3．引入適當(dāng)?shù)墓δ芑鶊F(tuán)或利用輔基本身合適的功能基團(tuán)將輔基偶聯(lián)到