【正文】 細(xì)胞分裂數(shù)。ngd249。ng)期,0 24 48 72 96 120 h,每代（群體）細(xì)胞生長(zhǎng)的四個(gè)時(shí)期,第二十四頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。ng)、核酸的原料）、維生素（輔酶、輔基）、 其他大量和微量元素、促生長(zhǎng)因子和激素（促進(jìn)細(xì)胞 生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能、保持細(xì)胞分化和未分化狀態(tài)） 培養(yǎng)環(huán)境條件要求嚴(yán)格：溫度、滲透壓（多數(shù) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞260~320mOsm∕kg）、pH（及溶氧量 CO2和HO）的相對(duì)恒定、剪切力等。iyǎng)條件和工具,一、培養(yǎng)條件： 1. 溫度： 2. pH： 3. 氣體： 4. 營(yíng)養(yǎng)： 二、培養(yǎng)工具(gōngj249。n)和工具,一、培養(yǎng)條件： 溫度：多數(shù)哺乳動(dòng)物37℃，偏離則影響代謝和 生長(zhǎng)(shēngzhǎng)。 O2 ？ CO2 ？ CO2培養(yǎng)箱？ 營(yíng)養(yǎng)：需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生長(zhǎng)因子。 種類：生物性液體（如血清）、組織浸液（如胚胎 浸液）、凝固劑（如血漿(xu232。含各種血漿蛋 白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生長(zhǎng)因子及無(wú) 機(jī)物等，在生理平衡下促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。oji224。用于原代和 細(xì)胞系的培養(yǎng)。i)的生理環(huán)境，且便于控制和標(biāo)準(zhǔn)化。也稱通用培養(yǎng)基（可用于 許多細(xì)胞）。,4.2.2 培養(yǎng)(p233。 包括兩部分(b249。iyǎng)條件——培養(yǎng)基,無(wú)血清培養(yǎng)基的添加成分： （1）細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）： 促進(jìn)貼壁。d242。,4.2.3 原代培養(yǎng)(p233。)，無(wú)菌取組織塊入小燒杯中，用尖嘴眼 科剪刀將組織塊剪碎，吸管吸取Hanks液沖下剪刀上 的碎片，補(bǔ)加35mLHanks液，用吸管輕輕吹打，低 速離心，棄去上清液，留下組織塊。)成片，布滿器皿表面時(shí)，則需 對(duì)其分離進(jìn)行重新培養(yǎng)。sh249。 （1）玻璃：明礬——硅硼膠玻璃。,4.2.4.2 貼壁培養(yǎng)的生長(zhǎng)(shēngzhǎng)特性,游離期：接種的細(xì)胞，懸浮，細(xì)質(zhì)回縮變圓。經(jīng)一段停滯，開(kāi)始分 裂。,4.2.5 動(dòng)物(d242。,4.2.5.1 懸滴培養(yǎng)(p233。,懸滴培養(yǎng)(p233。 優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)物交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境(hu225?？蓪⑴囵B(yǎng)物 接種在載玻片上，再入旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)，取載玻片觀察。)小室培養(yǎng)法,灌注小室培養(yǎng)法：最初由Burrows（1912年）設(shè) 計(jì)。 后來(lái)的許多大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)在設(shè)計(jì)上都參考了此 方法的原理。iyǎng)法,培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：培養(yǎng)物直接接種在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在放 入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。)和永 久保存；增加了培養(yǎng)面積。iyǎng)法,培養(yǎng)板培養(yǎng)法：將培養(yǎng)物接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)， 放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 常用的（一次性的）培養(yǎng)板：6孔、24孔、96孔 （96孔最常用）。包 括懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維 法、微多孔載體培養(yǎng)等。 動(dòng)物活體組織分散、過(guò)濾、離心、純化、漂 洗，接種到適宜培養(yǎng)液中，于特定培養(yǎng)條件下 培養(yǎng)。ng) 分散細(xì)胞,加培養(yǎng)液終止(zhōngzhǐ) 消化吹打分散 形成分散細(xì)胞,剪切成細(xì)快,酶消化、吹打(chuīdǎ)分散 形成細(xì)胞懸浮液,逐級(jí)稀釋,細(xì)胞懸浮液制備過(guò)程示意圖,…,第四十六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。o)簡(jiǎn)單，成本低，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行。,第四十七頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。bāo)免受機(jī)械損傷； 11.接種方便； 12.能固定大部分細(xì)胞； 13.適合大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)； 14.細(xì)胞載體培養(yǎng)基易分離； 15.適于貼壁和懸浮培養(yǎng)；,第四十八頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 20世紀(jì)80年代(ni225。,第四十九頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 3~6層空心纖維構(gòu)成培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞接種于空心纖 維的外腔。,第五十頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 微多孔載體培養(yǎng)：克服了其不足。,4.2.6.5 微多孔載體培養(yǎng)(p233。i)：1. 成球材料和臨時(shí)性成孔材料分散于介質(zhì) 中液滴，2. 液滴固化成小球，3. 去除（如高溫?zé)Y(jié)） 臨時(shí)性成孔材料，形成多孔微球，4.后期處理——表 面處理、清洗、滅菌等。ili224。b232。 1. 高溫?zé)Y(jié)法：玻璃、陶瓷等。itǐ)的制備方法,2. 高分子材料成球聚和法： 水（懸浮分散介質(zhì)）加分散劑，強(qiáng)力攪拌→不溶 于水的單體分散成小液珠→加引發(fā)劑（油溶性） →成 珠狀小球→100~105 ℃去除未反應(yīng)的單體和成孔物質(zhì)(w249。,2.4.6.5 微多孔載體的制備(zh236。,第五十六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。) →加熱、減壓、溶劑萃取、冰凍干燥等去除成孔材料 →多孔微球。因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁、非常脆弱、對(duì)剪切 敏感、對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格。 國(guó)外，氣升式反應(yīng)器已放大到5 000~10 000L，攪 拌式反應(yīng)器達(dá)到8 000L。 利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)具有獨(dú)特的 作用和意義，也是植物(zh237。 動(dòng)物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工較大或更復(fù)雜的 蛋白質(zhì)（特別是加工蛋白質(zhì)的環(huán)境、過(guò)程、結(jié)果等是 植物微生物細(xì)胞極少有的）；能將目的蛋白分泌到培 養(yǎng)液中，從而簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)的分離、純化。ngtǐ)免疫調(diào)節(jié)劑：如干擾素（IFN）、白細(xì)胞 介素（IL）、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BCGF）、巨噬細(xì)胞激 活因子（MAN）、T細(xì)胞替代因子(TRF)等。iyǎng)的應(yīng)用,酶類：組織血纖維溶酶原激活計(jì)（tPA）等； 激素：紅細(xì)胞生產(chǎn)素（EPO）、促黃體生成素 （LH）、促濾泡素（FSH）。,第六十一頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。ng) 1.氨離子 2.乳酸 3.二氧化碳 4.甲基乙二醛 5.滲透壓 6.載體 （二）細(xì)胞死亡與凋亡 （三）培養(yǎng)基與細(xì)胞系 （四）過(guò)程監(jiān)控,第六十二頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。氨的積聚（來(lái)源于培養(yǎng)基和細(xì)胞的代謝）使細(xì) 胞內(nèi)UDP氨基己糖增加，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)糖基化過(guò) 程。因此應(yīng)減少培養(yǎng)基中葡萄糖的濃 度（以減少乳酸）同時(shí)平衡葡萄糖與Gln的比例。ng)：,二氧化碳：CO2 累積改變 細(xì)胞(x236。 甲基乙二醛（MG)：為丙糖磷酸去磷酸基（主要）、 脂類、氨基酸代謝產(chǎn)物。加小牛血清可降低MG的濃度。ng)：,滲透壓：高滲透壓提高細(xì)胞生產(chǎn)抗體的濃度、影響對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期長(zhǎng)短、細(xì)胞死亡速度。,第六十五頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。d249。,第六十六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 細(xì)胞系或細(xì)胞珠不同，其無(wú)血清培養(yǎng)基需求不同， 在細(xì)胞早期培養(yǎng)階段(jiēdu224。)反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),（四）過(guò)程監(jiān)控： 因大量細(xì)胞的代謝，培養(yǎng)環(huán)境會(huì)迅速改變，過(guò)程的 再線監(jiān)控是非常重要的。)產(chǎn)物等是大 規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的需要。nzhu224。 4.目前對(duì)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究比較欠缺。,4.2.8 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀(xi224。 3.開(kāi)發(fā)細(xì)胞性能優(yōu)良、細(xì)胞解離容易，并能重復(fù)使 用的新型(xīnx237。,第七十頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。,第七十一頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。ich236。,4.3.1.3 組織工程修復(fù)(xiūf249。 其優(yōu)勢(shì)明顯、應(yīng)用前景誘人：運(yùn)用生物工程技術(shù)， 利用人體殘余器官的少量正常細(xì)胞進(jìn)行體外繁殖，既 可獲得患者急需的具有相同功能的器官，又無(wú)排斥反 應(yīng)，現(xiàn)已取得滿意的成果。 人們甚至正在嘗試：培育能充當(dāng)藥物釋放渠道 的組織。,4.3.2.1 上皮組織(sh224。zǔzhī)細(xì)胞：排列緊密、形態(tài)較一致、 有極少量的細(xì)胞間質(zhì)、被覆上皮分為單層和復(fù)層上皮 體外培養(yǎng)時(shí)： （1）部分保留體內(nèi)生長(zhǎng)的特征：成群存在或緊密 相連成單層膜，極少離群獨(dú)存，表現(xiàn)群體依賴性 。ngp237。n) 角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化；細(xì)胞接種密度抵、增殖 快、生長(zhǎng)穩(wěn)定、傳代較好。zǔzhī)的體外培養(yǎng),二、表皮組織的體外培養(yǎng)： 實(shí)驗(yàn)材料： 表皮細(xì)胞來(lái)源：外科手術(shù)取包皮、乳腺、腹部皮膚，流產(chǎn) 胎兒皮膚最好(zu236。 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM和F12 (3﹕1)加10%胎牛血 清、4 mmol∕L谷氨酰胺、青100IU∕ml、鏈霉素100 μg ∕ ml、5 μg ∕ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5μg ∕ml胰島素等。b232。,結(jié)果分析： 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)3~5天后開(kāi)始形成集落、擴(kuò)展； 10天左右集落融合(r243。,4.3.2.2 肌肉組織(jī r242。肌肉細(xì)胞(x236。,肌衛(wèi)細(xì)胞：乃骨骼肌細(xì)胞的干細(xì)胞（可被看作儲(chǔ)備 的成體細(xì)胞）。 成熟的骨骼肌細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂。（2）接種在10% CO飽和濕度 環(huán)境中培養(yǎng)。 肌肉細(xì)胞系的建立：肌細(xì)胞的連續(xù)選擇性傳代，低密度接 種到有（或無(wú)）飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板上，形成單細(xì)胞克隆，可 以避免肌源性表型的過(guò)早喪失。 培養(yǎng)對(duì)象、條件(ti225。（3）多聚賴氨酸液。,第八十六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。ng)的 神經(jīng)前體細(xì)胞。guān)培養(yǎng),4.4.1 概述： 器官培養(yǎng)(p233。,第八十八頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。tā)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、排除CO2和其他代謝廢物。器官保存無(wú) 細(xì)胞增殖。組織 培養(yǎng)物已喪失原器官的完整功能。,胚胎與成體(ch233。 （3）胚胎器官細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，遷移能力強(qiáng)，容易 從植快中遷移出來(lái)。guān)培養(yǎng)的特點(diǎn)： （1）能量來(lái)自有氧代謝，因此需充足的O2供應(yīng)， 器官植塊中心才不會(huì)缺氧而壞死。,4.4.3 傳統(tǒng)的器官(q236。表玻璃上加雞胚 質(zhì)和雞血漿→凝固→培養(yǎng)的器官移植其上→放入培養(yǎng) 皿內(nèi)→入箱培養(yǎng)。iyǎng)方法,瓊脂凝膠培養(yǎng)法： 培養(yǎng)液加瓊脂形成凝膠，故培養(yǎng)基質(zhì)不液化，器官 組織的細(xì)胞在其上的遷移(qiāny237。,4.4.3 傳統(tǒng)的器官(q236。,第九十五頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 器官型植塊置于液體培養(yǎng)基與氣象界面上培養(yǎng)， 植塊可同時(shí)獲取營(yíng)養(yǎng)和充足的氧氣。,4.4.3 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)(p233。 擦鏡紙（具有疏水性）漂浮在培養(yǎng)液的表面，作 為器官的支持物，營(yíng)養(yǎng)物可透過(guò)擦鏡紙進(jìn)入器官。 金屬格柵替代漂浮支持物（Trowell,1954）。,第九十八頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 優(yōu)點(diǎn)：可直接觀察器官的生長(zhǎng)情況；維持(w233。,4.4.3 傳統(tǒng)(chu225。ng)于旋轉(zhuǎn)管一側(cè)， 管內(nèi)加入適量培養(yǎng)液，水平旋轉(zhuǎn)進(jìn)行培養(yǎng)。guān)培養(yǎng)方法,搖擺式器官培養(yǎng)法： 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法雖是動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，但操作復(fù)雜。,4.4.4 現(xiàn)代器官(q236。空氣通 過(guò)過(guò)濾器進(jìn)入儲(chǔ)液罐對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行充氧和穩(wěn)定pH。,1938年，卡雷爾和林德伯格嘗試了采用無(wú)菌循環(huán)裝 置培養(yǎng)貓的甲狀腺，并維持?jǐn)?shù)星期。n) 污染，腦垂體保持正常的生長(zhǎng)素分泌能力。ngpǐn)收集口 15.CO2培養(yǎng)箱,第一百零四頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。材料常用胚胎動(dòng)物長(zhǎng)骨（最常用雞胚長(zhǎng)骨）取材 時(shí)注意動(dòng)物的年齡。,4.4.5.1 軟骨的培養(yǎng)：雞胚長(zhǎng)骨培養(yǎng)的操作過(guò)程： 1. 消毒孵化（8~9d）蛋，取出雞胚，洗凈。)，用Hanks液洗一次。,第一百零六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 具體操作步驟： 1. 乙醚麻醉懷孕大鼠，消毒、固定開(kāi)腹取子宮于培 養(yǎng)皿中，開(kāi)子宮取出鼠胎。存活期可達(dá)50天，發(fā)育與體內(nèi)相似。血管的培養(yǎng)方法很多。 2）將動(dòng)脈管置于培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液。1983年（Hart 和Conway）微擴(kuò)散單位裝置培養(yǎng)新生(xīnshēng)大 鼠的肝臟獲得成功。 4）2~3塊肝臟植塊置于中央孔表面濾紙上，用毛玻璃片蓋好 裝置。,,1,2,3,4,5,Conwey微擴(kuò)散(ku242。美國(guó)杜克大學(xué)的勞拉已經(jīng)把人體器官細(xì)胞生長(zhǎng) 技術(shù)應(yīng)用在豬身上，最終目標(biāo)是培養(yǎng)出人體動(dòng)脈。j236。,第一百一十一頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。血清的使用影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（原因與結(jié)果難以對(duì)應(yīng)）。去除小球中的冰晶，成多孔性