【正文】 5 min PCR 擴(kuò)增使用 TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（Code ） ，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增目的片段。如實(shí)驗(yàn)菌在半固體培養(yǎng)基中產(chǎn)氣，氣泡將穿刺線上的生長物擠亂。對生長快的細(xì)菌應(yīng)培養(yǎng)一天后觀察。用直引穿刺接種試驗(yàn)菌于半固體培養(yǎng)基內(nèi)，于適溫培養(yǎng)。 精氨酸雙水解反應(yīng)培養(yǎng)基：蛋白胨 1g，酚紅 ，牛肉膏 5g，L精氨酸鹽 10g，K 2HP04 ，蒸餾水 1000ml，瓊脂 6g，分裝試管，高度約 45cm。 卵磷脂酶測定培養(yǎng)基：無菌條件下取卵黃加等量的生理鹽水，搖勻后，取 10ml 上述懸液加入到融化的、約 5055℃的 200ml 牛肉膏蛋白胨中，混合均勻后倒人培養(yǎng)皿內(nèi)。凡測定菌在合有碳水化合物培養(yǎng)基中的生長情況明顯超過空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長情況者為陽性。如無紅色出現(xiàn)，則可加入一、二滴二苯胺試劑，此時如呈藍(lán)色反應(yīng)，則表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽，又無亞硝酸鹽反應(yīng)，表示無硝酸鹽還原作用：如不呈藍(lán)色反應(yīng)，表示硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已還原成其它物質(zhì)，故仍按硝酸鹽還原陽性處理。 硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基配方：肉汁胨培養(yǎng)液 100ml， KNO3 lg，每管分裝 45ml試劑：(1)格里斯氏試劑 (2)二苯胺試劑將測定菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，置適溫培養(yǎng) 5d。培養(yǎng) 25d，形成明顯菌落后，在平板上滴加碘液。如菌已生長，明膠末液化，但明膠表面菌苗下出現(xiàn)凹陷小窩(須與未接種的對照管比較，因培養(yǎng)過久的明膠因水份失散也會凹陷)也是輕度水解，按陽性記錄。 明膠水解培養(yǎng)基：蛋白胨 5g，明膠 100150g，水 1000ml，pH ，分裝試管，培養(yǎng)基高度約為 45 厘米取 1824h 的斜面培養(yǎng)物作穿刺接種,并有未接種的空白對照。如培養(yǎng)液中有吲哚時，吲哚可被提取在乙醚層中。取培養(yǎng)液和40％NaOH 等量相混，加少許肌酸，l0min 如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為試驗(yàn)陽性反應(yīng)，有時需要放置更長時間才出現(xiàn)紅色反應(yīng)。 甲基紅試驗(yàn)（. 試驗(yàn)）培養(yǎng)基：:蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，K 2HPO4 5g，水 1000ml，每管分裝 45ml接種試驗(yàn)菌于以上培養(yǎng)液中，每次二個重復(fù)，置適溫培養(yǎng) 5d(如為陰性可適食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究5當(dāng)延長培養(yǎng)時間)。在 10 秒鐘內(nèi)涂抹的菌苔現(xiàn)紅色者為陽性，1050s 現(xiàn)紅色者為延遲反應(yīng)，60s 以上現(xiàn)紅色者不計(jì)，按陰性處理。用革蘭氏染色，芽孢染色，用光學(xué)顯微鏡在油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài) [5,6]。食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究32. 材料與方法 主要儀器和培養(yǎng)基 主要儀器超凈工作臺光學(xué)顯微鏡細(xì)菌鑒定系統(tǒng) 主要培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨：牛肉膏 3g，NaCl 5g，蛋白胨 10g，水 1000ml, pH 病原菌的分離純化取一株病態(tài)（表面突起泛黃，有水珠）的杏鮑菇（10 g）置于 90 mL 無菌生理鹽水，振蕩 20 min，稀釋 100 倍，涂于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上。 蘑菇細(xì)菌性褐斑病。 干腐病主要危害蘑菇。病原該病由托拉斯假單胞桿菌引起。我國除對蘑菇細(xì)菌性病害研究外，還報道了平菇細(xì)菌性褐斑病及細(xì)菌性腐爛病，金針菇細(xì)菌性銹斑病等，防治上通過合理噴水保濕和及時通風(fēng)等措施可有效控制病害的發(fā)生 [2]。由于蘑菇細(xì)菌性病害分布廣、危害重，1982 年在英墾的溫室作物研究所召開了細(xì)菌性斑點(diǎn)病的國際會議，專門討論蘑菇細(xì)菌性病害問題。目前在杏鮑菇栽培過程中, 一些細(xì)菌性病害已成為生產(chǎn)中的一大障礙 , 嚴(yán)重時幾乎全部失敗。進(jìn)一步對其生理生化特性，分析 16SrRNA 序列，鑒定 S1 為 Pseudomonas putida，S2 為Pseudomonas marginais。根據(jù)革蘭氏染色和生化檢驗(yàn)結(jié)果，初步鑒這兩個菌株為假單胞菌屬。近年在杏鮑菇工廠化生產(chǎn)過程中出現(xiàn)了嚴(yán)重的污染菌，有些菇農(nóng)種植的杏鮑菇其污染率超過了 50％以上，杏鮑菇生產(chǎn)因污染菌造成的損失達(dá)億元以上。后來美國、法國、丹麥、英國、德國、荷蘭、澳大利亞等國相繼報道，并推廣用漂白粉水溶液進(jìn)行防治。比利時學(xué)者 M．GOOT 等人應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)對分離到的 20 多個菌株進(jìn)行了比較鑒定后分成 7 個類型。濕度大時, 凹斑內(nèi)有粘稠的菌液, 當(dāng)病斑干后,菌蓋往往開裂。病原據(jù)鑒定, 細(xì)菌性軟腐病是由一種螢光假單胞桿菌引起。病原該病由一種假單孢桿菌引起。 課題主要研究內(nèi)容從杏鮑菇生產(chǎn)廠（昆山正興食用菌有限公司）中污染的生產(chǎn)包分離純化，得到純菌落；查閱資料，做相關(guān)的生理生化實(shí)驗(yàn)；提取相關(guān)基因，測序，比對，鑒定實(shí)驗(yàn)菌的種類；查閱相關(guān)資料，考察不同的抗生素對實(shí)驗(yàn)菌的藥性，找出對該實(shí)驗(yàn)菌的防治措施。 病原菌的形態(tài)觀察及染色將病原菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上 30℃培養(yǎng) 24 h 后，觀察牛肉膏蛋白胨平板菌落形態(tài)、牛肉膏蛋白胨斜面菌苔形態(tài)、肉汁凍液體培養(yǎng)基中的生長情況。食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究4 氧化酶直接在菌苔上滴加鹽酸二甲基對苯二胺(或鹽酸對氨基二甲基苯胺)1％水溶液，不可過濕。 接觸酶將測定菌按種于適宜的斜面上，適溫培養(yǎng) 1824h 取一環(huán)培養(yǎng) 1824h 的菌苗涂于于凈的載破片上，然后滴上一滴 310％的過氧化氫，若有氣泡(氧氣)，則為接觸酶陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)。 乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（）培養(yǎng)基：蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，K 2HPO4 5g，水 1000ml， ，每管分裝 45ml接種試驗(yàn)菌于以上培養(yǎng)液中，每次 2 個重復(fù)，置適溫培養(yǎng) 2d．6d。培養(yǎng) 7d 的培養(yǎng)液，沿管壁緩緩加入 毫升的乙醚至培養(yǎng)液，充分震蕩，使乙醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚試劑。產(chǎn)黑褐色色素者為陽性，不產(chǎn)黑褐色素者為陰性。如明膠凝塊部分或全部在 20℃以下變?yōu)榭闪鲃拥囊后w，則為明膠水解陽性。取新鮮種菌點(diǎn)種，適溫培養(yǎng)。培養(yǎng) 1～7d，觀察含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有無氣泡，如產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氨氣，是陽性反應(yīng)；如不含硝酸鉀的對照培養(yǎng)基也產(chǎn)生氣泡則只能按可疑或陰性處理，不產(chǎn)生氣泡為陰性。結(jié)果觀察：當(dāng)培養(yǎng)液中滴入 A、B 液后，溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰色、橙色、棕色等表示亞硝酸鹽存在，為硝酸食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究7鹽還原陽性。適溫培養(yǎng) 14 天觀察。如生長差別仍不明顯，則按陰性處理。在菌落四周圍和下面有不透明的區(qū)出現(xiàn)，表示卵磷脂分解生成脂肪，說明有卵磷脂酶。 運(yùn)動性的檢查半固體瓊脂穿刺法。如生長物由穿刺線向四周呈云霧狀擴(kuò)放，其邊緣呈云霧狀，則表示試驗(yàn)菌株食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究8有運(yùn)動性。因?yàn)橛蝿恿θ醯募?xì)菌，在半固體培養(yǎng)基中第 12 天中尚不能從穿刺線游開，故需多培養(yǎng)幾天觀察。 16S rDNA 序列提取及測序委托寶生物工程（大連）有限公司測序 變性在培養(yǎng)基中挑取菌體于 50ul TaKaRa Lysis Buffer for Microanism to Direct PCR(Code )中變性后離心取上清作為模板。 抑菌劑的篩選 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)試劑卡藥敏鑒定 使用細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中的藥敏試劑卡對病害菌進(jìn)行多種抗生素的抑菌實(shí)驗(yàn)。本試驗(yàn)采用紙碟法：取 用平板涂布法將菌混勻密布于生長培養(yǎng)基的平板，同時以無菌鑷子取含抗生素的紙片于含菌平板上，置 30℃培養(yǎng) 2448h 后，取出觀察抑菌圈大小。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的料包在菌絲長滿之后進(jìn)入出菇環(huán)節(jié)，經(jīng)過正常的消毒環(huán)節(jié)后，會長出子實(shí)體，但隨著子實(shí)體的增大，菇體會出現(xiàn)大量黃色粘稠狀水珠，隨著培養(yǎng)時間的延長，被污染的菇體最終會腐爛，而與之接觸的健康菇體也會被感染出現(xiàn)相同的癥狀。結(jié)果表明，兩個樣本的培養(yǎng)結(jié)果類似，均出現(xiàn)了兩種細(xì)菌，證實(shí)了這一污染現(xiàn)象是由兩種微生物引起，分別為 CTE 722B 和 CTE 722C；只是兩者比例有差異，前者 CTE 722C 較多，CTE722B 較少，后者則反之。參照上述細(xì)菌分類鑒定手冊對假單胞菌的鑒定方法，進(jìn)行了其他生理生化試驗(yàn)，并和 Pseudomonas 的細(xì)菌進(jìn)行比較，結(jié)果見表表 菌株 S1 生理生化測定結(jié)果實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 S1 H262 biovar A氧化分解葡萄糖 + + +氧化酶 + +接觸酶 + + +乙醇氧化 / 產(chǎn)生吲哚試驗(yàn) 還原硝酸鹽反應(yīng) + + +反硝化作用 明膠液化 / 淀粉水解 精氨酸雙水解酶 + + +乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（） 甲基紅試驗(yàn)（） 硫化氫產(chǎn)生 水解七葉靈 / /厭氧生長 d卵磷脂酶測定 碳源的利用D葡萄糖 + + +D蔗糖 + / /D甘露醇 棉子糖 + + +食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究18L丙氨酸 + / /生長溫度41℃ 4℃ + + +注：+ 表示反應(yīng)為陽性； 表示反應(yīng)為陰性；d 表示 1189 菌株為陽性；/ 表示沒有數(shù)據(jù)報道從表中可以看出，菌株 S1 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和惡臭假單胞菌( ）基本一致，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色、運(yùn)動狀態(tài)、16S rDNA 等情況，斷定菌株 S1 為一株惡臭假單胞菌( ） 。 抑菌劑的篩選 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)試劑卡藥敏鑒定根據(jù)菌種的個別生理生化特征選擇了相應(yīng)的試劑卡：S1 使用的是腸桿菌科試劑卡，S2使用的是奈瑟菌/嗜血桿菌科試劑卡。菇保的抑菌毒力最高，甲酚皂抑菌毒力最低。食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究23圖 菇保隨時間的抑菌效果變化圖 甲酚皂隨時間的抑菌效果變化食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究24圖 苯扎溴銨消毒液隨時間的抑菌效果變化參考文獻(xiàn)[1] 呂作舟. 食用菌栽培學(xué)[M], 北京: 高等教育出版社. 2022:65—267[2] 劉克均. 食用菌病害研究進(jìn)展[J]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué). 世界農(nóng)業(yè). 1991,5: 3234[3] 張志焱. 食用菌細(xì)菌性病害及防治[J]. 植物醫(yī)生. 1999,12(1):56.[4] 張繼英. 熒光假單胞菌對食用菌的促生作用及其機(jī)理研究[D].河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2022.[5] 東秀珠, 蔡妙英主編. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京 : 科學(xué)出版社,2022.[6] Holt JG. 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