【正文】 反應?！　。玻┎菟徜@結(jié)晶紫染1分鐘?！　。叮┘?5%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后水洗，吸去水分。滅菌和消毒　　消毒和滅菌兩個詞在實際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。１）干熱滅菌法:　　：利用火焰直接把微生物燒死。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。該法一般在62176。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石炭酸，則效果更好。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100176。第2天再重復上述步驟，三次左右，就可達到滅菌的目的?！　〖訅赫羝麥缇前汛郎缇奈锲贩旁谝粋€可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在15~20分鐘便會被殺死，而達到滅菌目的。多數(shù)微生物的營養(yǎng)體和病毒在50~65176?！　?，數(shù)量越多，熱死時間越長。　　，這主要是由于一些離子發(fā)生化學反應而產(chǎn)生混濁或沉淀?！　　＃?、過濾　　采用機械方法，設計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器。但是比細菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時會給實驗帶來一定的麻煩。但是一種化學藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴格區(qū)分。培養(yǎng)基制備技術(shù) 一、玻璃器皿的清洗　　在制備培養(yǎng)基的過程中，首先要使用一些玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。對容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等，洗凈后注入濃鹽酸少許，轉(zhuǎn)動容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸，數(shù)分鐘后傾去鹽酸，再以流水沖凈，倒置于洗滌架上將水空干，即可使用。洗液的主要成份是重鉻酸鉀和濃流酸，其作用是將有機物氧化成可溶性物質(zhì)，以便沖洗。我們可根據(jù)某種標準，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基雖然不能確切知道它的化學成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實驗室常用的培養(yǎng)基?！　。常┌牒铣膳囵B(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學藥品即成半合成培養(yǎng)基?！　。保┮后w培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。在實驗室中，它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗雜菌、計數(shù)、保藏、生物測定等。３、根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分，可分為選擇培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。在某種程度上講，增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。　　有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。　　另外，根據(jù)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是否“完全”，可以分為基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基和補充培養(yǎng)基，這類術(shù)語主要是用在微生物遺傳學中。因此，除所用的是標準方法，應嚴格按其規(guī)定進行配制外，一般均應盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。完全稱取完畢后，還應進行一次檢查。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時擾動、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應重新制備。５、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正　　因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應進行PH的初步調(diào)正。６、培養(yǎng)基的過濾澄清　　液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應透明無顯著沉淀，因此 ，須要采用過濾或其它澄清方法以達到此項要求。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復過濾。C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。８、培養(yǎng)基的滅菌　　一般培養(yǎng)基可采用121176。明膠培養(yǎng)基亦應用較低溫度滅菌。９、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試　　每批培養(yǎng)基制備好以后，應仔細檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應挑出棄去。C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長，即棄去。放置時間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個的微生物菌落?！　。福┗铙w接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。為此，必須清掃室內(nèi)，關(guān)閉實驗室的門窗，并用消毒劑進行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數(shù)量。（圖３－４）然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復原?！D３－４　斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞二、分離純化　　含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）。１、傾注平板法　　首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50176。（圖３－５，b）３、平板劃線法　　最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。（圖３－７）４、富集培養(yǎng)法　　富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。接種后，加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同?！　值是細菌生長的很基本的特性常數(shù)。這種能量稱為維持能。微生物只有處于最適生長溫度時，生長速度才最快，代時最短。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點是恒定的。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。４）氧氣　　按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個類型。絕大多數(shù)微生物都屬于這個類型。這可能是由一它們含有在強氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。２、培養(yǎng)方法1）根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。一般可采用下列幾種方法：　?。撼⑦€原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達到目的。　　 用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮氣驅(qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣。微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察 １、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結(jié)構(gòu)（包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達到區(qū)別、鑒定微生物的目的。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內(nèi)容。（圖３－８）　圖３－８　細菌的培養(yǎng)特征 　?。玻┟咕湍妇呐囵B(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細菌的很相似，只是比細菌菌落大且厚。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗。C培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。培養(yǎng)5天?！　〉矸鬯庀抵鸩竭M行的過程，因而試驗結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系?！　≡囼灧椒ǎ骸　。保㎡’Meara氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36177。C恒溫箱，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。1176。C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應省去或以氯化鈉代替。C或30176?！　〖谆t為酸性指示劑，~。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。６、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗　　有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。進行試驗時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。平板試驗結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點種的菌落上滴加試劑，若為陽性，10~20min后，菌落周圍應出現(xiàn)清晰帶環(huán)?！　≡囼灧椒ǎ禾羧?8~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36177。９、氧化酶（Oxidase）試驗　　氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應。硫化氫（H2S）試驗　　有些細菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空，以不會被濺濕為適度；用管塞壓住置36177。1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。三、血清學試驗　　血清學反應是指：相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象?！　?)抗原體的結(jié)合是按一定比例進行的，只有比例適當時，才能出現(xiàn)可見反應。反應速度慢，需幾分、幾十分以至更長時間。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。是一種常規(guī)的定性試驗方法。此法快速、簡便，但不能進行定量測定。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進行流行病學調(diào)查。由于載體增大了可溶性抗原的反應面積。反應中的抗原稱為沉淀原，抗體為沉淀素?！　。玻┬鯛畛恋矸磻簩⒁阎乖c抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對應，而又二者比例適當時，會出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀，此為陽性反應。瓊脂擴散可分為單向擴散和雙向擴散兩種類型。由于方法簡便易行，常用于測定分析和鑒定復雜的抗原成分。因此，整個試驗需要有補體、待檢系統(tǒng)（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指示系統(tǒng)（綿羊細胞和溶血素）五種成份參加。無菌取樣技術(shù)　　本單元講述了無菌取樣操作，在討論無菌取樣的原因和采集方法之前，必須要理解“無菌的”的這一術(shù)語，“無菌”一般用于取樣中，意味著取樣過程中，避免操作引起污染。除非使用合適的采集工具，否則樣品的完整性會被懷疑，甚至樣品毫無意義。附加樣品號碼一般在樣品采集中被正式確定下來，因此不用預先標明。3．環(huán)境樣品：　　環(huán)境樣品用細菌拭子，（注：細菌拭子樣品不能給出／測出微生物的定時結(jié)果，因為樣品非常小，顯著微生物會經(jīng)常丟失），棉拭子的取樣部位一般來自于食品接觸面，地板噴濺物。　　滅菌容器：　　從塑料袋到滅菌的加侖漆桶，可以用于有銳利邊面的產(chǎn)品如蟹、蝦等?！　‘斢檬痔讜r必須用一種避免污染的方式戴上，手套的大小必須適合工作的需要?！　‘敳杉療o菌樣品時，一條最重要的規(guī)則是：千萬別污染樣品?！　∫话阏f來，進出口貿(mào)易合同對食品抽樣量有明確規(guī)定的，按合同規(guī)定抽樣；進出口貿(mào)易合同沒有具體抽樣規(guī)定的，可根據(jù)檢驗的目的，產(chǎn)品及被抽樣品批的性質(zhì)和分析方法的性質(zhì)確定抽樣方案?！　CMSF推薦的抽樣方案　　ICMSF的采樣設想及其基本方法　　用于分析所抽樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果會產(chǎn)生很大影響。（2）食品經(jīng)不同條件處理后，其危害度變化情況：①降低危害度；②危害度未變；③增加危害度，來設定抽樣方案并規(guī)定其不同采樣數(shù)?！　：系指合格菌數(shù)限量，將可接受與不可接受的數(shù)量區(qū)別開。ICMSF方法中包括二級法及三級法兩種。自然界中材料的分布曲線一般是正態(tài)分布，以其一點作為食品微生物的限量值，只設合格判定標準m值，超過m值的，則為不合格品。設有微生物標準m及M值兩個限量如同二級法，超過m值的檢樣，即算為不合格品。M值之間，如果有3個以上檢樣的菌數(shù)是在mamp。在中等或嚴重危害的情況下使用二級抽樣方案，對健康危害低的則建議使用三級抽樣方案。表ICMSF按微生物的危害度及食品處理進行情況分類級別危害程度對象微生物食品經(jīng)不同處理后的危害度減少（加熱）無變化（冷凍品立刻進食）增加危害度（未加熱吃到吃前還有一段時間）　三級方案　　細菌數(shù)大腸菌群大腸桿菌金黃色葡萄球菌（指標菌）金黃色葡萄球菌蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌例1n=5 c=3例4n=5 c=3　　例7n=7 c=2例2n=5 c=2例5n=5 c=2　　例8n=5 c=1例3n=5 c=1例6n=5 c=1　　例9n=10 c=1二級方案沙門氏菌副溶血性弧菌致病性大腸桿菌肉毒梭菌霍亂弧菌傷寒沙門氏菌副傷寒沙門氏菌例10n=5 c=0例13n=15 c=0例11n=10 c=0例14n=30 c=10例12n=20 c=3例15n=60 c=0注：表中“減少”系指食品經(jīng)加熱殺死污染的細菌?！　】紤]到以上15種情況，分別設定不同的取檢樣數(shù)及檢樣污染數(shù)，在19例種檢樣需采5個（n=5），而污染檢樣數(shù)設定為c=3，2，1。烹調(diào)加工后的熟肉，對腐敗菌沒有抵抗力，則易發(fā)生食物中毒，適用例9。如表2。（4）.隨機 抽樣方案　　在現(xiàn)場抽樣時，可利用隨機抽樣表進行隨機抽樣?！　?。　?。ㄈ绨碅即第49行的第11和12列的數(shù)字，為608）。三、抽樣方法　　確定了抽樣方案以后，抽樣方法對抽樣方案的有效執(zhí)行和保證樣品的有效性代表性至關(guān)重要。確定檢驗批，應注意產(chǎn)品的均質(zhì)性和來源，確保檢樣的代表性。3．統(tǒng)裝或大容器包裝的固體和固體食品：　　（1）．每份樣品應用滅菌抽樣器由幾個不同部位采取，一起放入一個滅菌容器內(nèi)；　?。?）．注意不要使樣品過度潮濕，以防食品中固有的細菌增殖。5．生產(chǎn)過程中的抽樣：　?。?）．劃分檢驗批次，應注意同批產(chǎn)品質(zhì)量的均一性；　?。?）．如用固定在貯液桶或流水作業(yè)線上的抽樣龍頭抽樣時，應事先將龍頭消毒；　　（3）．當用自動抽樣器取不需要冷卻的粉狀或固定食品時，必須履行相應的管理辦法，保證產(chǎn)品的代表性不被人為地破壞。標記應牢固，具防水性，字跡不會被擦掉或脫色