db21t 18612-20xx 水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗技術(shù)規(guī)程 擴增片段長度多態(tài)性法-預(yù)覽頁
【正文】 個基因可能有許多等位基因。群體或個體間的遺傳距離越小，它們之間的親緣關(guān)系越近，反之群體或個體間的遺傳距離越大，那么它們之間的親緣關(guān)系將越遠。由于不同來源DNA的酶切片段存在差異，因而產(chǎn)生了擴增產(chǎn)物的多態(tài)。 無水乙醇：分析純。 核糖核酸（RNA）酶：生化試劑。 過硫酸銨：分析純。 Taq DNA聚合酶（生化試劑，5 U/mL）。 乙二胺四乙酸（EDTA）：分析純。 ： 硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）溶于100 ml 超純水中。 梯度PCR儀。 單道可調(diào)移液器（ mL，10 mL，20 mL，100 mL，200 mL，1000 mL）。 冷凍離心機。 北京六一儀器廠DYYⅢ型電泳儀。 III型樣品：藻類（海帶、裙帶菜、鼠尾藻等）。隨機采取正常、健康個體樣品，數(shù)量不少于30個/群體。 Ⅲ 型樣品選取幼嫩藻尖，用毛筆在無菌海水中充分刷洗，解剖鏡下觀察，確定沒有附生雜藻后，在無菌蒸餾水中清洗，晾干備用。 Ⅱ型樣品取20℃，置于液氮中研成粉末；加DNA提取液(10mmol/L TrisHCl，pH ，75mmol/L NaCl，%SDS，5mmol/L EDTA)。65℃保溫15~60min，按GBT ，用苯酚和氯仿方法抽提DNA； (3mol/L，) 和兩倍體積無水乙醇沉淀；溶于50181。以DNA條帶的分子量及有無拖尾為標準判斷DNA的質(zhì)量。DNA濃度(μg/mL)=[A260／(L)]稀釋倍數(shù)，公式中的A260表示被測樣品在260nm波長下的吸光度值，L為比色池厚度，單位是cm。 AFLP分析 限制性內(nèi)切酶消化本規(guī)程統(tǒng)一采用EcoRⅠ/ MseⅠ雙酶切組合反應(yīng)體系。表1 限制性內(nèi)切酶消化反應(yīng)體系試劑原始濃度最終濃度體積（181。g/181。l總計————50181。L）基因組DNA酶切液EcoRⅠ 接頭(2PM/181。按表3配制預(yù)擴增體系，按表4進行PCR反應(yīng)。l)dNTPs (5mM)10X PCR緩沖液Taq酶 (5U/181。l)MseⅠ選擇擴增引物 (50ng/181。將梳子背面插入膠液中，吸出多余膠液，室溫下聚合2h。（6）上樣 用微量移液器取變性反應(yīng)物加到加樣孔內(nèi)，每孔上樣量為5~8181。（9）將上述膠板置于凝膠成像儀中，利用相關(guān)圖像采集系統(tǒng)得到清晰的電泳凝膠圖像，用于結(jié)果分析。 結(jié)果分析 利用群體遺傳學(xué)分析軟件專業(yè)（PopGene ），對建立的群體01數(shù)據(jù)陣列，按照顯性二倍體數(shù)據(jù)模型，進行等位基因數(shù)(Allele Number，Na)、有效等位基因數(shù)（Effective Allele Number，Ne）、多態(tài)性位點百分率 (Polymaorphic Loci P) 、Nei’s 基因多樣性指數(shù)（Gene Diversity，H）、Shannon多樣性指數(shù)(Shannon index，I) 、遺傳距離（Genetic Distance，D）等遺傳參數(shù)的分析和計算。3180。3180。MseⅠ預(yù)擴增引物：5180。MseⅠ選擇擴增引物：518
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