db21t18612-20xx水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程擴(kuò)增片段長度多態(tài)性法(專業(yè)版)
【正文】 MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物：5180。（9）將上述膠板置于凝膠成像儀中，利用相關(guān)圖像采集系統(tǒng)得到清晰的電泳凝膠圖像，用于結(jié)果分析。l)dNTPs (5mM)10X PCR緩沖液Taq酶 (5U/181。g/181。以DNA條帶的分子量及有無拖尾為標(biāo)準(zhǔn)判斷DNA的質(zhì)量。隨機(jī)采取正常、健康個(gè)體樣品，數(shù)量不少于30個(gè)/群體。 單道可調(diào)移液器（ mL，10 mL，20 mL，100 mL，200 mL，1000 mL）。 Taq DNA聚合酶（生化試劑，5 U/mL）。由于不同來源DNA的酶切片段存在差異，因而產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。5 試劑 三羥甲基氨基甲烷（Tris）飽和酚。 標(biāo)準(zhǔn)分子量Markers（100bp）。 電子天平（ mg）。樣品標(biāo)注后，活體運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。 DNA濃度檢測(cè)分別于260 nm波長和280 nm波長下測(cè)定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值。l5181。l)MgCl2 (25mM)超純水接頭連接液總計(jì)表4 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件94℃（初始變性）2 min94℃（變性）1 min26 個(gè)循環(huán)56℃（退火）1 min.72℃（延伸）1 min.72℃（終了延伸）5 min.選擇擴(kuò)增引物序列見附錄C，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10100倍作為選擴(kuò)增模板，按表5配制選擴(kuò)增體系，按表6進(jìn)行PCR反應(yīng)。9 數(shù)據(jù)分析選擇電泳后清晰的擴(kuò)增片段進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。GATGAGTCCTGAGTAA 3180。GACTGCGTACCAATTC 3180。（8）銀染 取下凝膠板，拆除耳板和邊條，將其置于10％冰醋酸中進(jìn)行固定，搖床上搖30min，將膠板轉(zhuǎn)入超純水中清洗3次，每次2min，將膠板置于銀染液中染30min，超純水沖洗5s后立即放入顯影液中，待條帶顯出后，用10％冰醋酸定影5min，自來水沖洗1min，晾干。l)MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物 (50ng/181。l5U乙?；Ｑ灏椎鞍?0181。L提取的DNA，用濃度1~2％瓊脂糖凝膠100V電泳 30 min，檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量。所采樣品標(biāo)注后，妥善存放，防止污損，做好采樣記錄。 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。 無水碳酸鈉：分析純。4 原理擴(kuò)增片段長度多態(tài)性法（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）的原理是對(duì)基因組總DNA酶切后經(jīng)PCR進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，先將基因組DNA用兩種限制性內(nèi)切酶酶切成大小不等的片段，并與含有粘性末端的人工接頭相連，形成酶切位點(diǎn)不同的限制性酶切片段，然后用與接頭和位點(diǎn)相匹配的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)一步PCR擴(kuò)增的模板，再選用特異引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳將特異的限制性片段分離。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)生物種質(zhì)檢測(cè)與鑒定等方面的種質(zhì)檢驗(yàn)工作。凡是不注日期的引用文件，其最新版
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