《分離工程第八章》ppt課件-全文預覽
【正文】 M ， 計算出被測樣品相對分子量 。同時蛋白質的結構也在 SDS作用下變的松散（蛋白質變成多肽），形狀趨于一致，排除了電泳過程中電荷的影響，使SDS—聚丙烯酰胺電泳時，蛋白質遷移率的差異僅是相對分子質量的函數(shù)。 ? 十二烷基硫酸鈉（ SDS)—聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?一種加陰離子去污劑 —SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳。 ?凝膠柱由二節(jié)凝膠組成（小節(jié)濃縮膠，大節(jié)分離膠）。 ?近來聚丙烯酰胺凝膠電泳法有了兩個新進展： ? A、不連續(xù)凝膠電泳。 緩沖系統(tǒng)的選擇原則 ?是兩種標準的對立權衡 –如果緩沖液的 pH選擇在遠離樣品中各種蛋白的等電點，蛋白質分子所帶電荷的密度大，電泳時間短，區(qū)帶細而窄； –如果緩沖 pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質的等電點，則蛋白質分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高； 因此，常常選擇 pH ~，常用的緩沖液有 Tris甘氨酸（ pH ~）， Tris硼酸 (pH ~)和 Tris醋酸（ pH ~） 離子強度的選擇 ? 離子強度不宜過高，此時電導率低，產熱少，電泳速度快；但也不可過低，必須具有一定的緩沖能力，過低的離子強度容易導致蛋白質絮凝。 常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理： ? 由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）是多孔介質，不僅能防止對流，把擴散減少到最低；而且其孔徑大小與生物大分子具有相似的數(shù)量級， 能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應 。 ?聚丙烯酰胺（丙烯酰胺）單體是神經毒素，可積累。 ?凝膠電泳：凝膠過濾作用（分子篩作用）電泳淌度正比于 電荷數(shù)（電荷效應） ?單位電場強度下的運動速度稱為離子淌度或遷移率。 ?（ 2）區(qū)帶電泳：在支持物上電泳時蛋白質混合物被成若干區(qū)帶。 ?瑞典管內蛋白質溶液和緩和液間有清晰可見界面，然后加一電場，由于界面處存在濃度梯度因而產生折射梯度，利用適當?shù)墓鈱W系統(tǒng)可以觀察到界面的移動。 ?電泳：是荷電溶質在電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。 ? 帶電粒子在電場中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小 和 形狀 、 分子所帶電荷 或 分子的生物學與化學特性 。 ?（ 1）自由電泳：是最早的一種電泳形式，目前已很少使用。 ?區(qū)帶電泳：應用支持介質的電泳，它表示在一個電場的作用下，在某一支持物上能將一個樣品組成徹底分離成若干條區(qū)帶的過程。 第一節(jié) 凝膠電泳法 ?凝膠電泳的作用是基于凝膠過濾作用（分子篩作用）和電泳淌度的雙重機理，所以它能獲得較高的分辨率。 A B C + ?常用的凝膠材料：聚丙烯酰胺、瓊脂糖凝膠。 垂直電泳槽及灌膠模具 電泳的一般過程 聚丙酰胺電泳 凝膠電泳與凝膠過濾的區(qū)別 ?在凝膠電泳中，樣品混合物中各分子的運動速度是小分子大于大分子物質，這種凝膠過濾中的情況恰好相反，這是因為在凝膠電泳中，系統(tǒng)里沒有空隙體積，只有充滿整體凝膠的網狀骨架，因此在其內部大分子物質不及小分子物質容易移動。因此，pH應限制在 3~10之間。 ? 根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為： –非排阻性凝膠（ unrestrictive gel） :濃
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