動物寄生蟲病pcr診斷技術(shù)-全文預(yù)覽
【正文】 收集管的UNIQ10柱中，室溫放置2 min，用臺式離心機高速（8000 rpm）離心1 min。切下來的膠塊放入一新鮮、 ml的離心管中，用電子天平稱重并作好記錄。(1) 切膠純化法(按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ5柱式DNA膠回收試劑盒說明進(jìn)行)：① 取40~50 181。而PCR產(chǎn)物直接回收法則是將擴增的PCR產(chǎn)物直接用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。在這樣的情況下，往往需要將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，然后經(jīng)菌落PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽性菌落進(jìn)行測序。如果擴增結(jié)果比較滿意，則用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝影，保存圖像。③ 電泳：接通電極，使DNA向陽極移動，在1～10 V/cm凝膠的電壓下（常用100 V）進(jìn)行電泳。① 制備凝膠：膠濃度視具體情況而定。(1) PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，于沸水中溶解，45℃開始形成多孔性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。這種擴增是通過模板DNA、引物之間的變性，退火（復(fù)性），延伸三步反應(yīng)為一周期（cycle），循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA片段得以擴增。⑧ 若是設(shè)計種或株特異性引物，引物與非特異序列的相似性不能超過70%或有連續(xù)8個以上的互補堿基相同。引物的5’末端修飾包括：加酶切位點，標(biāo)記生物素、熒光、同位素、地高辛等。兩個引物不應(yīng)有4個以上的堿基連續(xù)相同或互補；⑥ 引物的3’ 末端應(yīng)與目的片段完全相配。③ 堿基的組成盡量隨機，盡量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3’ 末端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C；④ 引物內(nèi)部不應(yīng)有互補序列，否則引物自身會折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身復(fù)性。由于G+C間的氫鍵數(shù)較A+T間多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。設(shè)計引物時要遵循以下原則：① 長度不能太長，也不能太短，一般在18～25個堿基左右；② G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%～60%為宜。（二）寄生蟲DNA的PCR擴增及瓊脂糖電泳。⑥ 將微型柱從注射器上轉(zhuǎn)移到一新的離心管上，在柱中央加入30～50181。② 取一支5ml的一次性注射器，去針頭，拔出注射器內(nèi)芯推液筒，接上WizardTM微型柱。首先進(jìn)行蟲體DNA提取，然后按Promega公司試劑盒WizardTM DNA CleanUp System使用說明對DNA進(jìn)行純化。l）的蛋白酶K溶液。用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過的微型眼科剪刀將蟲體組織剪碎，加入280181。以雙蒸水重懸，同法離心洗滌三次后，用20%次氯酸鈉處理卵囊20min，2000g離心沉淀卵囊，用適量飽和鹽水重懸卵囊沉淀，1500g離心10min，上清液加入4倍體積的滅菌雙蒸水，3000g離心10min。若蟲體較大，用鑷子將保存在70%的酒精溶液中的蟲體材料取出，剪取其中部，保存其頭端或尾端部分。純化時，DNA溶液與純化試劑盒中的清洗樹脂混合后，其混合液在通過微型柱時DNA會結(jié)合在柱上，而其它雜質(zhì)會通過微型柱排出；再用80%異丙醇進(jìn)行沖洗，去除殘余雜質(zhì)。從凍干或50%70%乙醇保存的寄生蟲材料中也可較容易地提取DNA。寄生蟲蟲體的各個部位都可以作為基因組DNA的抽提材料，如果蟲體較大的話可取其中部而保存其頭部及尾部，以備形態(tài)學(xué)鑒定以驗證其種類。3．試劑。2．器具。(1) 10PCR Buffer（無Mg2+）、dNTP（ mM each）、ddH2O 、MgCl2（25 mM）、Primers、Ex Taq酶（5 U/ml）、瓊脂糖、EB（10mg/ml）、Tris堿、硼酸（Boric acid）、去離子水、EDTA（ mol/L，pH ）、10載樣緩沖液。 超凈工作臺、微型高速臺式離心機、微量取液器（2/20/200/1000 181。(3) WizardTM DNA CleanUp 試劑盒或類似的DNA提取試劑盒。l 、100 mM TrisHCl（pH ）30 181。(1) 乙二胺四乙酸（ Ethylene diaminetetra acetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸（Tri (Hydroxymethyl) AminomethaneHCl，TrisHCl）、氯化鈉、蛋白酶K（25181。 單個蟲體。而且PCR技術(shù)的操作過程也相對簡便快捷，無需對病原進(jìn)行分離純化；同時可以克服抗原和抗體持續(xù)存在的干擾，直接檢測到病原體的DNA，既可用于蟲種、株的鑒別，動物寄生蟲病的臨床診斷，又可用于動物寄生蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查。通過設(shè)計種、株特異的引物，此法只擴增出種、株特異的PCR產(chǎn)物，具有很高的特異性。二、實驗儀器和材料（一）寄生蟲基因組D
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