【正文】 養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。添加后可得到健壯的植株。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)發(fā)育有促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小若超過１毫米時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。 ①椰乳 是椰乳的液體胚乳。 （ 5）天然復(fù)合物 其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其它的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。肌醇與 6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，參與細(xì)胞膜的構(gòu)建。 VB1對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用， VB6能促進(jìn)根的生長(zhǎng)， VPP 與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞 在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長(zhǎng)。 不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取，不能任意取量。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。如缺氮，會(huì)表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫，表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；缺錳或鉬，則影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)。也可構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。 在制做培養(yǎng)基時(shí)不用Ｆ e2（ＳＯ 4） 3和Ｆ eＣ l3 （因其在 pH５ .２以上，易形成Ｆ e（ＯＨ） 3的不溶性沉 淀），而用 Ｆ e ＳＯ 4 (5)微量元素 指小于 ， Ｆ e、Ｂ、Ｍ n、Ｃ u、Ｍ o、Ｃ o等。它 們常以Ｍ gＳＯ 4Ｋ增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加， 維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對(duì)胚的分化有促進(jìn)作用。在植物組織培 養(yǎng)過程中， 向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對(duì)Ｎ的吸收， 增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。有時(shí)，也添加氨基酸來補(bǔ)充氮素。在制備培養(yǎng)基時(shí)以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種形式供應(yīng)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。 ２Ｈ 2Ｏ 0． 25 H3BO3 ＫＩ ０ .８３ ０ .７５ 煙酸 (Vpp) ０ .５ ０ .５ 鹽酸吡多醇 (VB6) 0． 5 0． 1 鹽酸硫胺素 (VB1) ０ .１ ０ .１ 肌醇 100 甘氨酸 2 3 二、培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基的成分主要可以分水、 無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。 Ｈ 2Ｏ ２２ .３ ７ Ｚ nＳＯ ４ 常用培養(yǎng)配方如下： 表 3－ 1 MS 和 White 培養(yǎng)基配方表 有機(jī)物 ＭＳ (毫克 /升 ) Ｗ hite (毫克 /升 ) ＮＨ 4ＮＯ 3 １６５０ ＫＮＯ 3 １９００ ８０ Ｃ aＣ l2 ５．ＫＭ－８Ｐ培養(yǎng)基 它是 1974 年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是無機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。 其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適， 可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。多數(shù)以發(fā)明人的名字來命名， 如Ｗhite 培養(yǎng)基 ，Ｍ urashige 和Ｓ koog 培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱ＭＳ 培養(yǎng)基），也有對(duì)某些成分進(jìn)行改良稱作改良培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是Ｓ acks(1680)和Ｋ nop(1681)，他們對(duì)綠色 植物的成分進(jìn)行了分析研究， 根據(jù)植物從土中主要是吸收無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無機(jī)鹽組成的Ｓ acks 和Ｋ nop 溶液，至今仍在作為基本的無機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。因此，沒 有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。 2．植物組 織培養(yǎng)常用的設(shè)備和器材有：玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等；器械用具，如鑷子、剪刀、解剖刀、解剖針等；儀器設(shè)備，如超凈工作臺(tái)、冰箱、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱等。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。調(diào)節(jié)時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉Ｒ话銇碚f當(dāng)ＰＨ高于６ .５時(shí)，培養(yǎng)基全變硬；低于５時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。 １～２個(gè)大氣壓對(duì)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，２個(gè)大氣壓以上就對(duì)生長(zhǎng)有阻礙作用， ５～６個(gè)大氣壓生長(zhǎng)就完全停止，６個(gè)大氣壓細(xì)胞就不能生存。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉度較高的封口材料易引起通透性受阻，也導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受影響。如紅花、烏桕樹的愈傷組織。 2．光質(zhì) 光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的 增殖以及器官的分化都有明顯的影響。 桃胚在 2～ 5℃條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理， 有利于提高胚培養(yǎng)成活率。百合的最適溫度是 20℃、月季是 25～ 27℃、番茄是 28℃。 組織培養(yǎng)在最適溫度下生長(zhǎng)分化表現(xiàn)良好， 大多數(shù)組織培養(yǎng)都是在 23～ 27℃之間進(jìn)行，很多研究者采用了 25177。 ４．解剖針 解剖針用于深入到培養(yǎng)瓶中， 轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織。也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。鑷子太長(zhǎng)，使用起來不靈活。 在組織培養(yǎng) 中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿，包括 100、 250、 1000 毫升燒杯； 100、 1000 毫升量筒； 100、 1000毫升試劑瓶（棕色）等等?，F(xiàn)在多采用聚丙烯塑料膜作為封口，以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無須另外配蓋，使用時(shí)是非常方便的。 目前，培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿漸被塑料器皿所代替?？捎糜谂囵B(yǎng)較高的試管苗 ，另外也不易污染。由于瓶口較小，亦不易污染。 第二節(jié) 設(shè)備和器材 一、玻璃器皿 在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。 培養(yǎng)架上裝置日光燈時(shí)，可安裝定時(shí)開關(guān)鐘控制照明時(shí)間，植物組織培養(yǎng)的光照強(qiáng)度一般在 1000～ 4000 勒克斯（ lux）， 每天照明 10～ 16小時(shí)，也有的需要連續(xù)照明。寬度一般為60cm。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。 5．?dāng)R架 貯放高壓滅菌后等待接種的培養(yǎng)基。 放大４０倍以上操作需要有相當(dāng)熟練的技術(shù)和較好的工具。超凈空氣的流速為每分鐘 24～ 30m，這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會(huì)妨礙采用酒精燈對(duì)器械等的灼燒消毒。 2． 超凈臺(tái) 超凈臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)是操作方便自如，比較舒適，工作效率高，準(zhǔn)備時(shí)間短。接種箱可參考圖 2－ 1自行仿制。緩沖間最好也安一盞紫外滅菌燈，用以照射滅菌。 無菌操作室要求干爽安靜，清潔明亮，在適當(dāng) 位置吊裝 1～ 2 盞紫外線滅菌燈，用以經(jīng)常地照射滅菌。 三、接種室 接種室是是進(jìn)行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要操作室。通常以電作能源。更大規(guī)?；蛞蟾咝蕰r(shí)，可考慮采用液體自動(dòng)定量灌注設(shè)備。如果培養(yǎng)基溫度過高，測(cè)量時(shí)要調(diào)整 pＨ計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。電爐應(yīng)配有鋁鍋。 6．磁力攪拌器 磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如 各種化學(xué)物質(zhì)、瓊脂粉等 。 4．電子分析天平和托盤天平 電子分析天平精確度為 ，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、激素等微量藥品；托盤天平精確度為 ，用于稱取用量較大的糖和瓊脂等。洗滌室專門負(fù)責(zé)試管苗出瓶與培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室則負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。備有空干架，以空干涮凈的培養(yǎng)器皿。室內(nèi)應(yīng)配備大型水槽，用于培養(yǎng)器皿的洗滌，最好是內(nèi)襯白瓷磚的水泥槽。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。 3．組織培養(yǎng)具有：培養(yǎng)條件可以人為控制；生長(zhǎng)周期短；繁殖率高；管理方便；利于工廠化生產(chǎn)的特點(diǎn)。更重要的是應(yīng)降低組培苗工廠化生產(chǎn)的成本，只有降低成本，才能更好的投產(chǎn)應(yīng)用。以前靠常規(guī)方法推廣一個(gè)新品種要幾年甚至十多年，而現(xiàn)在快的只要l～ 2 年就可在世界范圍內(nèi)達(dá)到普及和應(yīng)用。組培苗的無毒生產(chǎn)， 可減少病害傳播，更符合國(guó)際植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)的要求，擴(kuò)大產(chǎn)品的流通渠道，增加產(chǎn)品市場(chǎng)的銷售能力，同時(shí)減少了氣候條件對(duì)幼苗繁殖的影響，緩和了淡、旺季供需矛盾。最后長(zhǎng)成和母株同樣的小植物體。 已有多種植物的經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生植物，有些植物得到體細(xì)胞雜種， 這無論在理論和實(shí)踐上都有重要價(jià)值。此外還有采用紫外 線、 X 射線、 ?射線對(duì)材料進(jìn)行照射，來誘發(fā)突變的產(chǎn)生。在常規(guī)育種中為得到純系材料要經(jīng)多代自交， 而單倍體育種，經(jīng)染色體加倍后可以迅速獲得純合的二倍體，大大縮短了育種的世代和年限。到五十年代在實(shí)踐上的應(yīng)用就更多了， 在桃、柑橘、菜豆、南瓜、百合、鳶尾等等許多園藝植物遠(yuǎn)緣雜交育種上都得到了應(yīng)用。已有不少地區(qū)建立了無病毒苗的生產(chǎn)中心，這對(duì)于無病毒苗的培養(yǎng)、鑒定、繁殖、保存、 利用和研究，形成了一個(gè)規(guī)范的系統(tǒng)程序，從而達(dá)到了保持園藝植物的優(yōu)良種性和經(jīng)濟(jì)性狀的目的。自從 Morel(1952)發(fā)現(xiàn)采用微莖尖培養(yǎng)的方法可得到無病毒苗后，微莖尖培養(yǎng)就成為解決病毒病危害的重要途徑之一。 的或種源較少的種苗。 快繁技術(shù)不受季節(jié)等條件的限制，生長(zhǎng)周 期短，而且能使不能或很難繁殖的植物進(jìn)行增殖。 1973 年 Carlson 等通過兩個(gè)煙草物種之間原生質(zhì)體融合，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種， Cocking 等倡導(dǎo)的原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交，研究得到了迅速發(fā)展， 已經(jīng)能使矮牽牛和煙草屬的雜種細(xì)胞增殖分化生成雜種植株。 1962 年印度 Guha 等人成功地在毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)中，由花粉誘導(dǎo)得到單倍體植株，這促進(jìn)了花藥和花粉培養(yǎng)的研究。 1935～ 1945 年 Muir 把單細(xì)胞放在一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養(yǎng)，使細(xì)胞發(fā)生了分裂，即實(shí)施了看護(hù)接種技術(shù)，使單細(xì)胞 培養(yǎng)獲得初步成功。 不久即知道激動(dòng)素可以代替腺嘌呤促進(jìn)發(fā)芽，并且效果可增加 3 萬倍。后來， White 于 1943 年發(fā)表了《植物組織培養(yǎng)手冊(cè)》專著，使植物組織培養(yǎng)開始成為一門新興的學(xué)科。與此同時(shí)， Gautheret(1934) 在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，提出了 B族維生素和生長(zhǎng)素對(duì)組織培養(yǎng)的重要意義，并于 1939 年連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。 Kotte 采用了無機(jī)鹽、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各種氨基酸的培養(yǎng)基。 第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)的發(fā)展 組織培養(yǎng)技術(shù)的蓬勃發(fā)展只是近 50年的事， 但它的整個(gè)歷史可以追溯至19世紀(jì)末和上世紀(jì)初。 ２．生長(zhǎng)周期短，繁殖率高 植物組織培養(yǎng)由于可人為控制培養(yǎng)條件， 根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同 的培養(yǎng)條件，因此生長(zhǎng)快，往往１個(gè)月左右為一個(gè)周期 。 4. 細(xì)胞培養(yǎng) (cell culture ) 是對(duì)由愈傷組織等進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)所得到的能保持較好分散性的離體單細(xì)胞或花粉單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)。 組織培養(yǎng)按培養(yǎng)對(duì)象可分為植株培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng) 、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)等。 通常我們所說的廣義的組織培養(yǎng)，是指通過無菌操作分離植物體的一部分 (即外植體 explant)，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其生成完整的植株。 3. 組織或愈傷組織培養(yǎng) (tissue or callus culture) 為狹義的組織培養(yǎng)，是對(duì)植物體的各部分組織進(jìn)行培養(yǎng)，如莖尖分生組織、形成層、 木質(zhì)部、韌皮部、表 皮組織、胚乳組織和薄壁組織等等；或?qū)τ芍参锲鞴倥囵B(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，二者均通過再分化誘導(dǎo)形成植株。 植物組織培養(yǎng)之所以發(fā)展如此快，應(yīng)用的范圍如此廣泛，是由于其具備以下幾個(gè)特點(diǎn)： １．培養(yǎng)條件可以人為控制 組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長(zhǎng)， 擺脫了大自然中四季、晝夜的變化、以及災(zāi)害性氣候的不利影響， 且條件均一，對(duì)植物生長(zhǎng)極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。 與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、 澆水施肥、防治病蟲等一系列繁雜勞動(dòng)，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。 1912 年， Haberlandt 的學(xué)生 Kotte 和美國(guó)的 Robins 在根尖培養(yǎng)中獲得了組織培養(yǎng)的成功。 這之后， white又以小麥根尖為材料， 研究了光、 溫度、通氣、 pH、培養(yǎng)基組成等各種培養(yǎng)條件對(duì)生長(zhǎng)的影響，并于 1937 年建立了第一個(gè)組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基， 其成份均為已知化合物，包括 3 種 B 族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，該培養(yǎng)基后來被定名為 White 培養(yǎng)基。 我們現(xiàn)在所用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，基本上都是由這三位科學(xué)家建立的。在尋找促進(jìn)細(xì)胞分裂的物質(zhì)過程中， Miller 等人于 1956 年發(fā)現(xiàn)了激動(dòng)素。 1952 年， morel 和 Martin 通過莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，從已受病毒侵染的大麗花中首次獲得無病毒植株。 80 年代中期以來，對(duì)禾谷類作物的原生質(zhì)體培養(yǎng)也相繼告捷，在這方面中國(guó)學(xué)者作出了重要貢獻(xiàn)。由于這一方法有很大的應(yīng)用價(jià)值， 很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起蘭花工業(yè)。 一、快速繁殖優(yōu)良種苗 用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖是生產(chǎn)上最有潛力的應(yīng)用，包括花卉和觀賞植物， 其次是蔬菜、果樹、大田作物及其它經(jīng)濟(jì)作物。 。 二、無病毒苗 (Virus free)的培養(yǎng) 幾乎所有植物都遭受到病毒病不同程度的危害， 有的種類甚至同時(shí)受到數(shù)種病毒病的危害， 尤其是很多園藝植物靠無性方法來增殖，若蒙受病毒病，代代相傳，越染越重。 組織培養(yǎng)無病毒苗的方法已在很多作物的常規(guī)生產(chǎn)上得到應(yīng)用，