【正文】 進(jìn)作用，但莖尖組織的大小若超過１毫米時，椰乳就不發(fā)生作用。添加后可得到健壯的植株。 在極低的濃度下，（１０－５～１０－８ mg/L）就可促進(jìn)生長。 2， 4－ D（ 2， 4－二氯苯氧乙酸）起動能力比ＩＡＡ高１０倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高， 但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。一般在器官形成后，添加赤 霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長。③抑 制根的分化。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。 加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比優(yōu)點(diǎn)在于操作簡便，通氣問題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等，但它也有不少缺點(diǎn)，如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸（即吸收）面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用，同時培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。對于剛感染的組織材料 ，可向培養(yǎng)基中注入5～ 10%的抗菌素。目前還沒有徹底完善的辦法，只能按不同的實(shí)際情況，加用一些藥物，并適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度、及時轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上等辦法，使之有不同程度的緩解，當(dāng)然象嚴(yán)格選擇外植體部位、加大接種數(shù)量等也應(yīng)一并考慮。 活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用，如在葡萄胚珠培養(yǎng)時向培養(yǎng)基加入 %的活性炭，可減少組織變褐和培養(yǎng)基變色，產(chǎn)生較少的愈傷組織。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。 下面以ＭＳ培養(yǎng)基制備為例，來概述其制備方法。 4．維生素、氨基酸母液 可配成 1mg/ml 母液。 NAA 可溶于熱水或少量９５％的酒精中，再加水定容到一定濃度。同時，稱好３０克蔗糖，稱瓊脂絲７克（或瓊脂粉），也傾入小鋁鍋中，邊加熱邊攪拌，防止糊底。在培養(yǎng)基配方不大變動的情況下可用經(jīng)驗(yàn)法。 7H2O 100 860 1000 100 液 2 CoCl分裝時不要把培養(yǎng)基弄到管壁上，以免日后容易污染。當(dāng)氣壓回 0 后打開鍋蓋，取出培養(yǎng)基，放于平臺上冷凝。要求對照組與試驗(yàn)組中 的試驗(yàn)個體，即植物組織塊或其它培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。正交試驗(yàn)雖然是多因素搭配在一起的試驗(yàn)，但是在試驗(yàn)結(jié)果的分 析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無誤地表現(xiàn)出來。目前，比較流行的培養(yǎng) 基有： MS培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高； B5 培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是含有較低的銨； White培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是無機(jī)鹽低，適于生根； N6培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是 KNO3 和（ NH4）2SO4 含量較高，適于花藥培養(yǎng)； KM－ 8P培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是有機(jī)成分較多，適于原生質(zhì)體培養(yǎng)。其中，第一種方法比較簡單，第二種方法比較準(zhǔn)確，而后兩種方法則比較復(fù)雜。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時便可大量滋生。要達(dá)到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長。在 的壓力。在這樣的條件下進(jìn)行操作，就叫做無菌操作。菌的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見。 10Mpa， 20分鐘。此外，還有廣譜實(shí)驗(yàn)法等。為了減少試驗(yàn)處理，但又能準(zhǔn)確全面地獲得試驗(yàn)信息，通常采用正交試驗(yàn)。 一、單因子試驗(yàn) 單因子試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中其它成分都維持在一般水平上，只變動一個因子，以找出這一因子對試驗(yàn)的影響和影響的程度，例如 MS基本培養(yǎng)基的其它成分和用量都不變，只變動 NAA 用量對某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。然后蓋上鍋蓋，對角旋緊螺絲，接通電源加熱，當(dāng)升至 時，打開放氣閥放氣，回“ 0”后關(guān)閉放氣閥。但要根據(jù)培養(yǎng)對象來決定。 7H2O 370 10 3700 KH2PO4 170 10 1700 MnSO4 培養(yǎng)基配好后，要調(diào)整 PH值。均置入１０００ ml定容瓶中 ,若不加任何激素，則為ＭＳ０培養(yǎng)基；若需加激素按配方移取激素母液即可。然后才能加水定容。用分析 天平按表準(zhǔn)確稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至 1000ml。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液， 其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。 所謂母液是欲配制液的濃縮液，這可保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時的快速移取，并便于低溫保藏。 活性炭在生根時有 明顯的促進(jìn)作用，其機(jī)理一般認(rèn)為與活性炭減弱光照有關(guān)，可能是由于根頂端產(chǎn)生促進(jìn)根生長的 IAA，但 IAA易受可見光的光氧化而破壞，因此活性炭的主要作用就在于通過減弱光照保護(hù)了 IAA，從而間接促進(jìn)了根的生長，由于根的生長加快，吸收能力增強(qiáng)，反過來又促進(jìn)了莖、葉的生長。這些物質(zhì)滲出細(xì)胞 外就造成自身中毒，使培養(yǎng)的材料生長停頓，失去分化能力，最終變褐死亡。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丟棄成百上千瓶的培養(yǎng)物，采用適當(dāng)?shù)目股乇憧晒?jié)約人力、物力和時間。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家 的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、 pH值等因素有關(guān)，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。 5．培養(yǎng)材 料的支持物 (1) 瓊脂 在固體培養(yǎng)時瓊脂是最好的固化劑。 在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個作用：①誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長，細(xì)胞分裂素與生長素相互作用，當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素／生長素的比值高時，誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化出不定芽。此外，赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響，當(dāng)生長素／赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。 NAA 和 IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖。 （ 1）生長素類 在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長生長。用量為１５０～２００克 /升。一般使用濃度在１０～２０％，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。 (3)肌醇 又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。在大規(guī)模生產(chǎn)時，可用食用的綿白糖代替。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長。Ｂ、Ｍ n、Ｚ n、Ｃ u、Ｍ o、Ｃ o 等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會導(dǎo)致生長，分裂異常。用量為１～３ mg/l較為適宜； Ｃ a 是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ｃ a對細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以Ｃ aＣ l2 (3)鉀 是植物營養(yǎng)Ｎ、Ｐ、Ｋ之一。銨態(tài)氮對植物生長較為有利。 它是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。 ７Ｈ 2Ｏ ３７０ ７２０ Ｋ H2ＰＯ 4 １７０ Ｆ eＳＯ 4 其特點(diǎn)是成分較簡單，ＫＮＯ 3 和（ＮＨ 4） 2ＳＯ 4含量高。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。而到 60 和 70年代則大多采用ＭＳ等高濃度培養(yǎng)基， 可以保證培養(yǎng)材料對營養(yǎng)的需要， 并能生長快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入 ,也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。 復(fù)習(xí)思考題 1．因地制宜建一個組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，需要哪些組成部分？各部分的作用是什么？ 2．常規(guī)組織培養(yǎng)時，需要什么設(shè)備和器械？你是否會用？ 3．組織培養(yǎng)中， PH 有什么作用？如果 PH 過高或過低會有什么后果？ AAAA4．談?wù)劷M織培養(yǎng)中如何根據(jù)外植體的不同調(diào)整適宜的培養(yǎng)溫度？ 第三章 培養(yǎng)基 目的要求： 1．一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn)和各自的作用 2．掌握基本培養(yǎng)基的配方 3．一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量 4．掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟 5．熟練掌握培養(yǎng)基的分裝和滅菌方法 6．一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。 通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥， 夏季易引起污染。 表 2１ 不同植物的最適 pＨ值 種 類 最適 PH 值 種 類 最適 PH 值 杜 鵑 4． 0 月 季 5． 8 越 桔 4． 5 胡蘿卜、石刁柏 6． 0 蠶 豆 5． 5 桃 7． 0 番茄、葡萄 5． 7 pＨ值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。 前者又受瓊脂含量的影響。 二、光照 組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一， 主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時間方面： 1．光照強(qiáng)度 光照強(qiáng)度對培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響， 從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對外植體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。低于 15℃時培養(yǎng)，組織會表現(xiàn)生長停止，高于 35℃時對生長不利。 分離莖尖分生組織，有時也用解剖刀。根據(jù)操作的需要有各種類型，若用１００毫升的三角瓶作為培養(yǎng)瓶， 可用２０厘米長的鑷子。以前封口常用棉塞。工廠化生產(chǎn)可采用廣口的 200ml罐頭瓶，加蓋半透明的塑料蓋，由于瓶口大，所以大量繁殖時操作方便、 工作效率高，也減少了培養(yǎng)材料的損傷。 最常使用的是三角瓶，規(guī)格有 100、 250、 500 毫升等， 一般使用 100 毫升三角瓶，無論靜止或振蕩培養(yǎng)皆適用。要求溫度因熱帶植物和寒帶植物等的種類不同而異，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要的培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其它附屬設(shè)備而定。 3． 解剖鏡 解剖鏡種類較多， 用于分離微莖尖可采用雙筒實(shí)體解剖鏡。 圖 2－ 1 接種箱構(gòu)造圖 長 700cm,上寬 300cm，下寬 450cm，高 500cm。 無菌操作室應(yīng)設(shè)有緩沖間，面積 2 m2 為宜。用于干燥需保 持 80～ 100℃；進(jìn)行干熱滅菌需保持 150℃，達(dá)１～３小時；若測定干物重，則溫度應(yīng)控制在 80℃烘干。 9．培養(yǎng)基分裝設(shè)備 小型組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室可采用燒杯、漏斗等作為分裝培養(yǎng)基的工具。 7．恒溫水浴鍋 水浴鍋用于難溶藥品的溶解、瓊脂的溶化等。 2．藥品柜 用以放置常 用藥品。備有大型塑料筐，用于放置培養(yǎng)器皿。在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。 本章小結(jié) 1．植物組織培養(yǎng)是指分離單個或多 個細(xì)胞或植物體的一部分，在人工配制的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使之長成一株完整植株的過程。 1985 年僅蘭花一項(xiàng)，在美國注冊的公司就有 100余家，年銷售額在一億美元以上。 四、工廠化育苗 近 年來，組培苗工廠化生產(chǎn)已作為一種新興技術(shù)和生產(chǎn)手段，在園藝植物的生產(chǎn)領(lǐng)域蓬勃發(fā)展。 突變的產(chǎn)生因部位而異，莖尖遺傳性比較穩(wěn)定， 根、莖、葉乃至愈傷組織和細(xì)胞的培養(yǎng)則變異率就較大。 如用花藥培養(yǎng)單倍體植株；用原生質(zhì)體進(jìn)行體細(xì) 胞雜交和基因轉(zhuǎn)移；用子房、胚和胚珠完成胚的試管發(fā)育和試管受精等 ；種質(zhì)資源的保存等等。 組織培養(yǎng)突出的優(yōu)點(diǎn)是 “快”，通過這一方法在較短時期內(nèi)迅速擴(kuò)大植物的數(shù)量，以一個莖尖或一小塊葉片為基數(shù)，經(jīng)組織培養(yǎng)一年內(nèi)可增殖到 10,000～ 100,000株。 第三節(jié) 組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系 植物組織培養(yǎng)成為生物科學(xué)的一個廣闊領(lǐng)域， 除了在基礎(chǔ)理論的研究上占有重要地位， 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也得到越來越廣泛的應(yīng)用。 1971年， Takebe 等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株， 這不僅在理論上證明了無壁的原生質(zhì)體同樣具有全能性，而且在實(shí)踐上為外源基因的導(dǎo)入提供了理想的受體材料。 即這一比例高時，產(chǎn)生芽；這一比例低時，則形 成根； 相等則不分化。 自 Haberlandt 的實(shí)驗(yàn)之后，直到 1934 年美國的 White 由番茄根建立了第一個活躍生長的無性繁殖系， 并反復(fù)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，使根的離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)獲得了真正的成功，并在以后 28 年間培養(yǎng)了 1600 代。 ３．管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制 植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，極利于高度集約化的高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。 2． 器官培養(yǎng) (an culture) 即離體器官的培養(yǎng)，根據(jù)作物和需要的不同 ,可以分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實(shí)等外植體的培養(yǎng)。 １．植株培養(yǎng) (plant culture) 是對完整植株材料的培養(yǎng)，如幼苗及較大植株的培養(yǎng)。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需一定設(shè)備及能源消耗， 但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說成本低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。 Robins 用含無機(jī)鹽、加葡萄糖或果糖的瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)了長度為 厘米的豌豆、玉米和棉花的莖尖，形成了一些缺綠的莖和根。 四十年代 Skoog 和崔徵在煙草莖切段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷可以解除培養(yǎng)基中生長素 (IAA)對芽形成的抑制作用，而能誘導(dǎo)形成芽，從而明確了腺嘌呤與生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。 1960 年， cocking 等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功。 在整個組織培養(yǎng)發(fā)展的歷史中， 我國學(xué)者 做出多方面的貢獻(xiàn)，除了前述的崔徵的工作以外， 還有 1993 年李繼侗等關(guān)于玉米等植物離體根尖培養(yǎng)的工作，以及羅士韋關(guān)于幼胚和莖尖培養(yǎng)，李正理關(guān)于離體胚培養(yǎng)、王伏雄等關(guān)于幼胚培養(yǎng)的工作。 由于組織培養(yǎng)周期短，增殖率高及能全年生產(chǎn)等特點(diǎn)，加上培養(yǎng)材料和試管苗的小型化，這就可使有限的空間培養(yǎng)出大量的植物，在短期內(nèi)培養(yǎng)出大量的幼苗。 三、在育種上的應(yīng)用