【正文】 酸 Arg）， 該寡肽為具蛋白酶活性的 凝血因子 Xa的識別和作用序列 ， 其斷裂位點(diǎn)在 Arg的 C末端 。 幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中 Arg、 Glu或 Lys殘基 C末端切開酰胺鍵 ， 形成不含上述殘基的下游肽段 。 化學(xué)斷裂法 特點(diǎn)： 前提： 回收率高 （ 達(dá) 85%以上 ） ；專一性強(qiáng)；產(chǎn)生的目的蛋白 N端不含甲硫氨酸 ， 與真核生物中的成熟表達(dá)產(chǎn)物接近 。 4） 兩基因應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架 。 目的蛋白需要回收： 融合蛋白需裂解和進(jìn)一步分離 ， 才能獲得目的蛋白 。 融合型表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)： 1） 目的蛋白穩(wěn)定性高： 對分子量較小的多肽效果更佳 。 將 細(xì)菌素釋放蛋白 編碼基因克隆在一質(zhì)粒上 ， 與另一攜帶 編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化 ，可實現(xiàn)目的蛋白的分泌 。 分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)： 1） ， 真核基因很難在 。 蛋白產(chǎn)物 N端 信號肽 序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提 。 疏水柱復(fù)性 凝膠柱復(fù)性 分泌型表達(dá) 以可溶性或不溶性包涵體狀態(tài)存在于 細(xì)胞質(zhì) 。 超濾復(fù)性： 缺點(diǎn)： 樣品量少時不適用，有些蛋白質(zhì)在超濾過程中會發(fā)生不可逆變性。 HS HS + GSSG S S 2GSH + 包涵體復(fù)性的方法： 稀釋復(fù)性 透析復(fù)性 超濾復(fù)性 柱上復(fù)性 缺點(diǎn)： 體積增加較大 ， 變性劑稀釋速度快 、 不易控制 。 二硫鍵形成： 在包涵體變性體系中 ， 始終存在 還原劑 (如 DTT、 ?ME)， 使多肽鏈中的巰基保持還原狀態(tài) ， 防止二硫鍵錯配導(dǎo)致嚴(yán)重的集聚 。 溶解能力強(qiáng) ， 但價格昂貴 。 包涵體的變性與復(fù)性操作 蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動力學(xué)原理： C1 C2 Cn C U I1 In N X1 X2 Xn X A1 A2 An A 集聚的中間狀態(tài) A： 集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì) U： 變性狀態(tài)的蛋白質(zhì) I： 有效變 /復(fù)性過程的中間狀態(tài) N： 天然狀態(tài)的蛋白質(zhì) C： 共價修飾的蛋白質(zhì) X：脫離有效變 /復(fù)性過程而進(jìn)入 共價修飾 和 集聚狀態(tài) 的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過程 ， 成為無活性的蛋白質(zhì) 。 變 /復(fù)性效率對目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要 ，也 是一 技術(shù)難題 。 50%以上是 外源基因表達(dá)產(chǎn)物 ， 氨基酸序列正確 ，但空間構(gòu)象往往錯誤 ， 無生物活性 。 （三）大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略 包涵體型表達(dá) 分泌型表達(dá) 融合型表達(dá) 寡聚型表達(dá) 整合型表達(dá) 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包涵體型表達(dá) ，形成無活性 、 不溶于水 的固體顆粒 ， 稱為 包涵體 (Inclusion Bodies, IB)。 措施： 將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入 可控制 的軌道 。 可將這兩個 tRNA編碼基因克隆在另一高效表達(dá)質(zhì)粒上 ， 構(gòu)建雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng) 。 表達(dá)量高的基因含有較少種類的密碼子 ，這些密碼子又對應(yīng)于高豐度的 tRNA分子 ， 以便細(xì)胞能以更快的速度合成需求量大的蛋白質(zhì) 。 弱配對作用可能使氨?；?tRNA進(jìn)入核糖體A位需要花費(fèi)更多的時間 。 生物體對密碼子偏愛性的決定因素： 生物基因組中的堿基含量； 密碼子與反密碼子相互作用的自由能； 細(xì)胞內(nèi) tRNA的含量。 緊鄰 AUG的前 3個堿基 也會影響翻譯起始效率 。 SD序列與起始密碼子之間距離的影響： SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證mRNA在核糖體上定位后 ， AUG正好處于 P位， 這是翻譯啟動的前提 。 2） 翻譯起始密碼子： AUG作為翻譯起始密碼子 ， 但有些基因也使用 GUG或UUG作為翻譯起始密碼子 。 結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率 ， 差別高達(dá)數(shù)百倍 。 P T 強(qiáng)終止子的選擇與使用： 對終止作用較弱的終止子 ， 可采用 二聚體 終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu) ， 以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止作用 。 2） 若外源基因下游緊接載體的重要功能基因 ，則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄 ， 可能干擾其生物功能 ， 甚至導(dǎo)致其不穩(wěn)定性 。 cI857 Ptrp A IAA 去阻遏 B P?L 目的基因 阻遏作用 B 表達(dá) P?L Ptrp A Trp 目的基因 cI857 應(yīng)是誘導(dǎo)型的 ， 可通過簡單方式 、 使用廉價誘導(dǎo)物誘導(dǎo) ， 如溫度誘導(dǎo) 、 IPTG誘導(dǎo) 。 除去 Trp 高效轉(zhuǎn)錄 Otrp Ptrp 或加入 IAA 在培養(yǎng)體系中 ， 去除 Trp或加入 3吲哚丙烯酸 (IAA)，可解除阻遏作用 。 Plac Olac 野生型 Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起 。 外源基因持續(xù)高效表達(dá)的重組質(zhì)粒 ， 在細(xì)胞若干次分裂后 ， 會部分甚至全部丟失 ，導(dǎo)致重組菌 不穩(wěn)定 。 10區(qū)和 35區(qū)的堿基組成及其間隔序列： 大多數(shù) 點(diǎn)之間的距離是 69bp， 但對外源基因而言 ，這個距離范圍未必最佳 。 啟動子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的 距離 。 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游 35bp處 ， 由 10bp組成 ， 5’TGACA。 （二）外源基因在 強(qiáng)化蛋白質(zhì)生物合成 抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)物降解 恢復(fù)蛋白質(zhì)特異性空間構(gòu)象 啟動子 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子 質(zhì)?？截悢?shù) 強(qiáng)化蛋白質(zhì)生物合成 啟動子 (promoter, P) 啟動子： 位于結(jié)構(gòu)基因上游 ， 能被 RNA聚合酶識別 、 結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段 DNA序列 ， 長 4060bp 。 ： 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的翻譯后加工修飾系統(tǒng)，如糖基化、磷酸化； 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能，表達(dá)產(chǎn)物多以無活性的包涵體形式存在； 內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定； 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素，痕量內(nèi)毒素即可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。 RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。 TGACA TATAAT 35區(qū) 10區(qū) +1位 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) 開始轉(zhuǎn)錄 10區(qū) 和 35區(qū) 的堿基組成及其間隔序列 。 10和 35區(qū)的間距越接近 17bp， 啟動子活性越強(qiáng) 。 3）啟動子的構(gòu)建： 35 區(qū)序列 10 區(qū)序列 啟動子 來 源 Plac Ptrp P?L PrecA Ptac T T T A C A T T G A C A T T G A C A T T G A T A T T G A C A T A T A A T T T A A C T G A T A C T T A T A A T T A T A A T Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 雙 Plac串聯(lián) = Plac 乳糖操作子 色氨酸操作子 ?噬菌體早期操作子 recA基因 Ptrp35區(qū) + Plac10區(qū) 4）啟動子的可控性： 外源基因的全程高效表達(dá) ， 會對 生理生化 過程造成不利影響 。 乳糖啟動子 Plac的可控性： 高效轉(zhuǎn)錄 乳糖 、 IPTG誘導(dǎo) Plac