大腸桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)及其acra和mara基因分析-全文預(yù)覽
【正文】 istance increased by over expression of marA in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 1997,63(4):1428. 圖1 SEMR、SEICI、ATCC25922菌株基因組DNA提取物的瓊脂糖電泳Figure 1 gelose gel electrophoresis with Genome DNA of ATCC25922,SEMR and SEICI.1:λ－Hind Ⅲ digest DNA Marker。因為細(xì)菌的耐藥有著多種而復(fù)雜的機制[14]，一種或幾種機制可能同時作用于某一種/一類抗菌藥，多種耐藥機制錯綜的作用于不同的各類藥物，可能是導(dǎo)致本實驗中這種耐藥的不整齊性的主要原因。由此還可以聯(lián)想到，在目前人們對付病原菌耐藥性尚沒有確實有效的辦法的情況下，倒可以如世界衛(wèi)生大會（World Health Assembly, WHA）[13]敦促的那樣，在消除對病原菌人為的選擇性環(huán)境壓力，減少對耐藥性的誘導(dǎo)方面多下些功夫。本實驗中另外的氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株只對頭孢噻肟一種抗菌藥產(chǎn)生了耐藥。大腸桿菌是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的一種細(xì)菌，在埃希氏大腸桿菌上發(fā)現(xiàn)了約30種外輸泵，但一般認(rèn)為AcrAB－TolC是最主要的外輸泵[10]。由于外輸泵種類較多，作用底物廣泛（包括抗菌藥、染料、消毒劑、洗滌劑、有機溶劑、親脂陽離子、脂類、抗微生物多肽類、化學(xué)藥物等），所以主動外輸系統(tǒng)介導(dǎo)的耐藥性呈現(xiàn)多重耐藥的特點[6～9]。 acrA、marA基因序列的測序結(jié)果由DNAsis軟件分析測序結(jié)果表明，acrA和marA克隆質(zhì)粒序列，在ATCC2592SEMR和SEICI都一致，與GenBank中發(fā)表序列同源性為100%，acrA和marA基因在四環(huán)素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株均沒有發(fā)生突變。白色的菌落為疑似陽性克隆，需做進(jìn)一步的鑒定。 SEMR、SEICI、ATCC25922 acrA、marA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果acrA、marA %瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker DL2,000為對照，結(jié)果在約1194bp和390bp處分別出現(xiàn)特異的目的片段，與預(yù)計的片段大小吻合。 誘導(dǎo)株的耐藥性變化四環(huán)素、環(huán)丙沙星和氯霉素三個誘導(dǎo)株的MIC變化詳見表2。取5181。37℃恒溫水浴2~4h。l； NcoⅠ，1181。將經(jīng)過電泳篩選出的疑似陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行NcoⅠ和NotⅠ雙酶切反應(yīng)，同時做陰性克隆質(zhì)粒的酶切對照。 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：參照《分子克隆指南》[5]進(jìn)行。l；T4 DNA Ligase，1181。l；PCR產(chǎn)物（2ng/181。%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳觀察PCR結(jié)果。 耐藥譜的確定上一步最后獲得的誘導(dǎo)劑濃度達(dá)到128MIC的耐藥株，作4次無誘導(dǎo)劑傳代培養(yǎng)后，再分別測定三個誘導(dǎo)株對所有受試抗菌藥的MIC，以確定三個誘導(dǎo)株的多重耐藥譜。鑒定確認(rèn)為ATCC25922的菌株作后續(xù)實驗之用。－CTA GCT GTT GTA ATG ATT TAA TGG－3180。－TTA AGA CTT GGA CTG TTC AGG CTG－3180。*通訊作者 Email：zhw5148..分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物：DNA Marker DL2,000、λ－Hind Ⅲ digest DNA Marker，均為TaKaRa公司產(chǎn)品。載體與質(zhì)粒：克隆載體為pGEM－T，Promega公司產(chǎn)品。本實驗用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星通過人工體外誘導(dǎo)大腸桿菌使之產(chǎn)生耐藥性，對AcrA和MarA的基因acrA和marA進(jìn)行測序分析，檢測耐藥性產(chǎn)生與acrA和marA突變的關(guān)系。大腸桿菌是畜禽的重要致病菌，是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的細(xì)菌，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了約30種外輸泵。結(jié)果 四環(huán)素誘導(dǎo)株產(chǎn)生多重耐藥，氯霉素和環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)引起單藥耐藥；四環(huán)素誘導(dǎo)株、氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株的acrA和marA基因序列均與ATCC25922的一致。方法 分別用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星對大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，測定誘導(dǎo)前后多種抗菌藥的MIC的變化；對各菌株的acrA和marA基因進(jìn)行克隆和測序?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞膜上的外輸泵（efflux pump）的表達(dá)水平提高，能主動將擴(kuò)散入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物或其他底物泵出菌體外，從而使細(xì)菌獲得非特異性的耐藥性。MarA是一個正調(diào)控蛋白，可增強acrAB和tolC的表達(dá)。染色試劑：結(jié)晶紫酒精飽和溶液、草酸銨溶液、革蘭氏碘溶液、石碳酸復(fù)紅溶液等按《藥品微生物學(xué)檢驗手冊》[3]進(jìn)行配制。研究方向：耐藥機理。；下游引物（PACR－R）5180。下游引物（PMAR－R）5180。. 方法 菌株鑒定對購進(jìn)的菌株作生化和形態(tài)鑒定，以確保菌株的可靠性：用營養(yǎng)肉湯作復(fù)蘇培養(yǎng)，再將菌液接種于瓊脂平板37oC培養(yǎng)至長出菌落；取上一步得到的單菌落進(jìn)行糖發(fā)酵試驗（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖）、靛基質(zhì)試驗、V—P試驗鑒定及革蘭氏染色的光鏡觀察。 誘導(dǎo)分別在三種含1/2MIC誘導(dǎo)劑的麥康凱培養(yǎng)基接種適量培養(yǎng)物（約105CFU），37oC培養(yǎng)24h，挑選生長良好的菌落，接種于1MIC誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基37oC培養(yǎng)24h，以此類推，逐漸提高培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑的濃度直到誘導(dǎo)前MIC的128倍（據(jù)細(xì)菌生長情況誘導(dǎo)劑濃度提高幅度可在1～2倍于原濃度的范圍適
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